| 研究概要 |
1.in vitro DNA複製系の検討
GroEで再生したRep蛋白は、イニシエーターとして働く際に重要なiteronへの結合活性は非常に高い。しかしFullerらのFraction IIにこれを加えても、pSC101のin vitro DNA複製は起こらなかった。単にGroEで再生したRep monomerではiteronへの結合活性は高くてもイニシエーター活性が無いか、あるいはFullerらのFraction IIにはpSC101の複製に必要なfactorが足りないものと思われる。
Rep蛋白のdiner形成に関わる領域の同定及び変異型Rep蛋白の単離
Rep蛋白のN末端には、ロイシンが7アミノ酸ごとに4回繰り返したロイシンジッパー構造を取り得る領域がある。このモチーフ内の2番目あるいは3番目のロイシンをグリシンまたはプロリンに変えた4種類の変異型Rep蛋白を作製し、その性質を調べた。
その結果いずれの変異型Rep蛋白もin vivoにおいて、イニシエーター活性、リプレッサー活性ともに低下していた。マルトース結合蛋白との融合蛋白の形で精製し,in vitroにおけるDNA結合活性を調べたところ、monomer型が結合するdirect repeat,dimer型が結合するinverted repratいずれに対しても結合能が低下した。塩酸グアニジン変性後再生しmonomer化した融合蛋白でもdirect repeatへの結合が弱かったことから、1アミノ酸の置換でDNA結合活性そのものが低下したものと思われる。4種類の変異型Rep蛋白がnative formでmonomerなのかdimerなのかまだ同定できていないが、モチーフ内の2番目、3番目のロイシンはDNA結合活性そのものに重要であることが分かった。
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