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多様な生理応答に見られるMAPキナーゼの核移行の生理的意義

研究課題

研究課題/領域番号 07780606
研究種目

奨励研究(A)

配分区分補助金
研究分野 分子生物学
研究機関岐阜薬科大学

研究代表者

佐藤 仁彦  岐阜薬科大学, 薬学部, 助手 (00240945)

研究期間 (年度) 1995
研究課題ステータス 完了 (1995年度)
配分額 *注記
1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
1995年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
キーワードDominant Negative Mutant / MAPキナーゼ / MDCK細胞 / HGF / 核移行 / クロスリンク
研究概要

1.MAPキナーゼのDominant Negative Mutant遺伝子を導入・発現させた細胞株の作製
MAPキナーゼの変異遺伝子をelongation factor promoterの下流に組み込んだ発現プラスミドを作成し、数種類の細胞に導入した後G418に対する薬剤耐性を指標に細胞を選別した。その結果、分散運動系のモデルであるMDCK細胞で、内在性MAPキナーゼの数倍量変異体が発現している細胞株を幾つか得ることができた。
2.H F刺激によるMAPキナーゼの活性と局在性の変化の解析
1.で得られたMDCK細胞株及び親細胞においてHGF刺激によるMAPキナーゼの活性化に余り差は認められなかったものの、キナーゼ活性を欠損させた変異体や非リン酸化型変異体を発現している細胞株では、HGF刺激による分散運動がやや遅れる傾向を示した。このことから、これらの変異体がDominant Negative Mutantとして働き得る可能性が示唆された。
次に、MAPキナーゼの局在性の変化について蛍光抗体法により解析したところ、(1)MDCK細胞ではHGF刺激によりMAPキナーゼが核移行する、(2)不活性型変異体および非リン酸化型変異体も核移行することからMAPキナーゼの活性及びリン酸化は核移行に関与しない、ことが明らかになった。
3.クロスリンク法によるMAPキナーゼ結合蛋白質の解析
G0期に同調させたSwiss3T3細胞を血清で刺激し架橋剤で処理した後、ウエスタンブロッティングを行ない抗MAPキナーゼ抗体を用いて解析したところ、刺激前に見られた分子量約160および135kDaのバンドが刺激後5分で消失した。このことから、刺激前にMAPキナーゼに結合していた分子量約120および95kDaの蛋白質が、MAPキナーゼの活性化に伴い外れることが示唆された。

報告書

(1件)
  • 1995 実績報告書
  • 研究成果

    (3件)

すべて その他

すべて 文献書誌 (3件)

  • [文献書誌] Shoji Iwasaki: "Distribution and characterization of specific cellular binding proteins for bone morphogenetic protein-2." J.Biol.Chem.270. 5476-5482 (1995)

    • 関連する報告書
      1995 実績報告書
  • [文献書誌] Yuji Chatani: "Cell type-specific modulation of cell growth by transforming growth factor β1 does not correlate with mitogen-activated protein kinase activation." J.Biol.Chem.270. 30686-30692 (1995)

    • 関連する報告書
      1995 実績報告書
  • [文献書誌] 佐藤仁彦: "生体の科学 第46巻 第5号" (財)金原一郎記念医学医療振興財団, 2 (1995)

    • 関連する報告書
      1995 実績報告書

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公開日: 1995-04-01   更新日: 2016-04-21  

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