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本年度は、ZO-1結合蛋白質であるZO-2について解析を進めた。
【マウスZO-2遺伝子の単離】
ZO-2遺伝子についは、ヒト遺伝子が同定されていたため、その配列をもとにマウス肺のcDNAライブラリーをスクリーニングし、マウスZO-2遺伝子を単離した。
【バキュロウイルスによる蛋白質発現】
ZO-1およびOccludinなどとの結合様式を解析するために、バキュロウイルスを用いた蛋白質発現系にマウスZO-2遺伝子を導入した。これにより、多量に可溶性のZO-2蛋白質を得ることが可能となった。さらに、N末側とC末側に分けた形の分子についても発現させ、結合実験に使用した。
【ZO-1およびOccludinとの結合実験】
ZO-2は、免疫沈降によりZO-1と結合することが示されていたが、今回組み替え蛋白質を用いた実験系により、結合が直接的であることが具体的に明らかとなった。さらに、結合部位を絞り込むことを試みたところ、ZO-1のN末から約1/4の領域とZO-2のN末側が結合することを示す結果が得られた。一方、ZO-1の、Occludin細胞質領域に対する結合部位を調べた結果、ZO-2と配列上相同性のあるN末側であった。そこで、ZO-2のN末側とOccludinの結合を調べたところ、両者が直接結合しうることが示された。
以上の結果から、ZO-2はZO-1と類似した構造を有し、少なくとも蛋白質間相互作用という点について構造上の相同性が共通の機能に反映していることが明らかとなった。
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