| 研究課題/領域番号 |
07807054
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
消化器内科学
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
油谷 浩幸 東京大学, 医学部・付属病院, 助手 (10202657)
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| 研究分担者 |
郡司 俊秋 東京大学, 医学部・付属病院, 医員
児玉 龍彦 東京大学, 先端科学技術研究センター, 教授 (90170266)
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| 研究期間 (年度) |
1995 – 1997
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| 研究課題ステータス |
完了 (1997年度)
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| 配分額 *注記 |
2,300千円 (直接経費: 2,300千円)
1997年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
1996年度: 600千円 (直接経費: 600千円)
1995年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
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| キーワード | C型肝炎ウイルス / RNA ポリメラーゼ / HCV / RNAポリメラーゼ / マイナス鎖RNA / トランスジェニックマウス / C型肝炎ウィルス / RNAポリナラーゼ |
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| 研究概要 |
[目的] C型肝炎ウイルス(HCV)は一本鎖のRNAウイルスであり、その増殖にはNS5b領域にコードされているHCV由来RNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)活性が必須であると推定されている。今回の我々の目的は、活性を有するHCV由来RdRpをmammmalianの培養細胞系において発現させることである。
[方法] HCV-1b(日本型)のNS5b領域とgreen fluorecence protein(GFP)とのfusion proteinをCHO細胞において発現させ、蛍光を発する細胞株を選択した(NS5b-GDD(+))。negative-controlとしてポリメラーゼの活性に必須であると推定されるGDD領域を欠失させた変異株を作成し、同様にGFPとのfusion proteinとしてCHO細胞に発現させた(NS5b-GDD(-))。発現させたRNAポリメラーゼが活性を有するか否かは、細胞内において転写されたプラス鎖HCV-RNAを鋳型として、マイナス鎖HCV-RNAが合成されるか否かを判定する事により行った。すなわち、細胞より抽出したRNAをRNase free DNaseにより消化した後、RNA3'末修飾法を用いる事によりプラス鎮及びマイナス鎖HCV-RNAをそれぞれ特異的に検出した。
[成績] (1)NS5b-GDD(+)CHO細胞株において10^3〜10^4PCRtiterのプラスHCV-RNAを認めた。本細胞株において10^2〜10^3titerのマイナス鎖HCV-RNAが検出された。(2)対象のNS5b-GDD(-)CHO細胞林においてはGDD(+)株と同様に10^3〜10^4PCRtiterのプラス鎖HCV-RNAを認めたが、マイナス鎖HCV-RNAは検出されなかった。
[討論] NS5b-GDD(+)はプラス鎖HCV-RNAの1/10〜1/100titerのマイナス鎖HCV-RNAを合成した。NS5bよりGDDを欠失させるとこの機能は消失した。
[結論] マイナス鎖計抗を合成する機能を持ったHCV由来RNAポリメラーゼをCHO細胞に発現させた。
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