| 研究課題/領域番号 |
07808066
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
生物有機科学
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
渋谷 雅明 東京大学, 薬学部, 助手 (50170923)
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| 研究期間 (年度) |
1995
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| 研究課題ステータス |
完了 (1995年度)
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| 配分額 *注記 |
2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
1995年度: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
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| キーワード | エンドウ / サイクロアルテノール / サイクラーゼ / cDNA / クローニング / PCR |
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| 研究概要 |
水浸4日後のエンドウの芽生えからRNAを抽出し、逆転写酵素により一本鎖のcDNAを合成した。これを鋳型に、アラビドプシスのサイクロアルテノールサイクラーゼ(CYC)のN末、およびC末のアミノ酸配列に対応する合成オリゴDNA((AT-NcoI、及びAT-BamHI)をプライマーとして用いてPCRを行った。しかしながら、期待する大きさの生成物をアガロース電気泳動で検出することができなかった。次に、アラビドプシスのCYCとカンジダのラノステロール合成酵素において極めて相同性の高い二つのアミノ酸配列KGAWPFST及びYPYVECTに基づくオリゴDNA(467S及び、556A)を合成し、 ″nested″ PCRを行った。一回目のPCR(467S、AT-BamHI)では、アガロース電気泳動上はっきりしたバンドを検出できなかったが、二回目のPCR(467S、556A)において、289bpのバンドを検出することができた。この生成物をプラスミドベクターにサブクローニングし塩基配列を決定したところ、アラビドプシスのCYCとDNAレベルで79%、アミノ酸レベルで84%の相同性を示した。次に、この289bpの塩基配列を基に、5′及び3′RACE法により、全長クローンのクローニングを行った。全領域の塩基配列を決定したところ、アラビドプシスのCYCとDNAレベルで76%、アミノ酸レベルで80%の相同性を示した。得られた配列をもとにPCRを行い、全長クローンを得た。得られた全長クローンをGAL1プロモータの下流につなぎ、酵母に導入した。ガラクトースで発現を誘導し、酵素活性を調べたところ、CYCの活性を検出することができ、得られたクローンはCYCをコードしている遺伝子であると判断した。
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