標的遺伝子組換えの迅速・簡便法の開発

• 研究課題/領域番号: 08044303
• 研究種目: 国際学術研究
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 共同研究
• 研究分野: 分子生物学
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 續 輝久 九州大学, 医学部, 教授 (40155429)
• 研究分担者: ROBERTSON Ge オタワ大学, 医学部, 準教授 ; 中別府 雄作 九州大学, 生体防御医学研究所, 教授 (30180350) ; 早川 浩 九州大学, 医学部, 助手 (70150422) ; RANCOURT Sus カルガリー大学, 医学部, 助手 ; RNCOURT Derr カルガリー大学, 医学部, 準教授 ; RANCOURT Derrick E. University of Calgary, Faculty of Medicine Dept.of Medical Biochemistry, Associa ; ROBERTSON George S. University of Ottawa, Faculty of Medicine Dept.of Pharmacology, Associate Profes ; RANCOURT Der カルガリー大学, 医学部, 準教授 ; SUE Rancourt カルガリー大学, 医学部, 助手
• 研究期間 (年度): 1996 – 1997
• 研究課題ステータス: 完了 (1997年度)
• 配分額: 4,200千円 (直接経費: 4,200千円); 1997年度: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円); 1996年度: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
• キーワード: 標的遺伝子組換え / ジーンターゲティング / 相同組換え / λファージ / プラスミド / ターゲティングベクター / ネガティブ選択

研究概要

標的遺伝子組換えの有用性は手法が開発されて10年にも満たない現時点で、既に生命科学分野の重要課題である発生・発がん・免疫・神経系など多くの基礎的研究、医学的応用面での研究にも大きく貢献してきている。現在ではレポーター遺伝子の挿入や微細な変異の導入も可能となりさらに応用の幅が広がっているが、標的遺伝子組換えの最初の段階であるターゲティング・ベクターの構築はいまだに時間的な制約となっている。この点を解決しさらに系統的かつ簡便に点突然変異などの微細変異の導入を目的としたターゲティング・ベクターを構築するシステムを開発することが本研究の目的である。
ネガティブ選択マーカーを組み込んだファージ-プラスミドのベクター系を開発した。アンバー3重変異を持つλSyrinxファージを用い、アンバー変異を抑制するSupF遺伝子断片とポジティブ選別マーカーのneo耐性遺伝子の融合カセットを構築して系を確立した。系の開発段階初期でのhprt遺伝子座をターゲットとした予備実験の結果を踏まえ。cRABPI遺伝子についてもneo及びlacZ-neo(レポーター)遺伝子を導入することができた(印刷中)。この系の改良により、効率良くしかも系統的に点突然変異などの微細変異の導入を目的としたターゲティング・ベクターを構築するシステムが開発できる見通しがたった。具体的な応用としてfosB及びΔfosB遺伝子の発現改変ベクターを作製することとし、平成9年夏に續・中別府がカルガリ-大学のRancourt博士並びにこの遺伝子の脳領域での発現に詳しいオタワ大学のRobertson博士の研究室を訪れて相談した。平成10年1月にRancourt博士を招聘し、今後の具体的な戦略を立てた。3月下旬に中別府がカルガリ-大学を訪れ、新しく開発した系によるターゲティングベクター構築ライブラリー作製の進展状況の把握並びに、ES細胞の操作について共同実験をすることにしている。本研究による相互訪問の過程(共同実験・セミナー・ディスカッション)で、新たにカルガリ-大学のRiabowol博士のグループとINGI遺伝子について共同研究することに決まり、平成10年度からスタートする国際学術共同研究で展開したいと考えている。

研究成果

• [文献書誌] Tuzuki,T.: "Embryonic stem cell gene targeting using bacteriophage λ vectors generated by phage-plasmid recombination." Nucleic Acids Res.(in press). (1998)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Crocker S.J.: "Dl-receptor-related priming is attenuated by antisense-mediated‘knockdown'of fosB expression." Mol.Brain Res.53. 69-77 (1998)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Taddei,F.: "Counteraction by MutT protein of transcriptional errors caused by oxidative damage." Science. 278. 128-130 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Oda,H.: "Expression of the human MTH1 gene encoding S-oxo-dGTPase:Alternative splicing of transcription products." J.Biol.Chem.272・28. 17843-17850 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Yakushiji,H.: "Biochemical and physicochemical characterization of normal and variant forms of human MTH1 protein with antimutagenic activity." Mutat.Res.384・3. 181-194 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Porter,D.W.: "Sensitivity of Escherichia coli(MutT)and human(MTH1)8-oxo-dGTPase to in vitro inhibition by carcinogenic metals;nickel(II),copper(II),and cadmium(II)." Carcinogenesis. 18・9. l785-1791 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Iwakuma,T.: "High incidence of nitrosamine-induced tumorigenesis in mice lacking DNA repair methyltransferase." Carcinogenesis. 18・8. 1631-1635 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Sakumi,K: "Methylnitrosourea-induced tumorigenesis in MGMT gene knockout mice." Cancer Res.57. 2415-2418 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Tominaga,Y.: "Alkylation-induced apoptosis of embryonic stem cells in which the gene for DNA repair methyltransferase had been disrupted by gene targeting." Carcinogenesis. 18・5. 889-896 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Goto,H.: "A single-point mutation in HCF causes temperature-sensitive cell-cycle arrest and disrupts VP16 function." Genes & Dev.11. 726-737 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Chen,J.: "Chronic Fos-related antigens:Stable variants of ΔFosB induced in brain bu chronic treatments." J.Neurosci.17・3. 4933-4941 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Cai,J.-P.: "Significance of the conserved amino acid sequence for human MTH1 protein with antimutator activity." Nucleic Acids Res.25・6. 1170-1176 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Humphries,M.M.: "Retinopathy induced in mice by targeted disruption of the rhodopsin gene." Nature Genet.15・62. 216-219 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] lgarashi,H.: "Organization and expression of the mouse MTH1 gene for preventing transversion mutation." J.Biol.Chem.272・6. 3766-3772 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Rancourt,S.L.: "Murine subtilisin-like proteinases SPC6 is expressed during embryonic implantation,somatogenesis,and skeletal formation." Develop.Genet.21. 75-8l (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Hollen,K.M.: "Changes in expression of ΔFosB and the Fos family proteins following NMDA receptor activation in the rat striatum." Mol.Brain Res.47. (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Hollen,K.M.: "Changes in expression of ΔFosB and the Fos family proteins following NMDA receptor activation in the rat striatum." Mol.Brain Res.47. (1997)31-43
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Igarashi, H., Tsuzuki, T., Kakuma, T., Tominaga, Y.and Sekiguchi, M.: "Organization and experssion of the mouse MTH1 gene for preventing transversion mutation" J.Biol.Chem.272. 3766-3772 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Cai, J.-P., Kawate, H., Ihara, K., Yakushiji, H., Nakabeppu, Y., Tsuzuki, T.and Sekiguchi, M.: "Significance of the conserved amino acid sequence for human MTH1 protein with anitmutator activity" Nucl.Acids Res.25. 1170-1176 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Humphries, M.M., Rancourt, D.E., Parrar, G.J., Kenna, P., Hazel.M., Bush, R.A., Sieving, P.A., Sheils, D.M., McNally, N., Creighton, P., Erven, A., Boros, A., Gulya, K., Capecchi, M.R.and Humphries P.: "Retinopathy induced in mice by targeted disruption of the rodopsin gene." Nature Genet.15. 216-219 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Tominaga, Y., Tszuki, T., Shiraishi, A., Kawate, H.and Sekiguchi, M.: "Alkylation-induced apoptosis of embryonic stem cells in which the gene for DNA-repair methyltransferase had been disruppted by gene targeting" Carcinogenesis. 18. 889-896 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Sakumi, K., Shiraishi, A., Shimizu, S., Tsuzuki, T., Ishikawa, T.and Sekiguchi, M.: "Methylnitrosourea-induced tumorigenesis in MGMT gene-knockout mice" Cancer Res.57. 2415-2418 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Iwakuma, T., Sakumi, K., Nakatsuru, Y., Kawate, H., Igarashi, H., Shiraishi, A., Tsuzuki, T., Ishikawa, T.and Sekiguchi, M.: "High incidence of nitosamine-induced tumorigenesis in mice lacaking DNA repair methyltransferase." Carcinogenesis. 18. 1631-1635 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Chen, J., Kelz, M.B., Hope, B.T., Nakabeppu, Y.and Nestler, E.J.: "Chronic Fos-related antigens : Stable variants of DELTAFosB induced in brain by chronic treatments." J.Neurosci.17. 4933-4941 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Rancourt, S.L.and Rancourt, D.E.: "Murine subtilisin-like proteinase SPC6 is expressed during embryonic implantation, somatogenesis, and skeletal formation." Develop.Genet.21. 75-81 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Goto, H., Motomura, S., Wilson, A.C., Feiman, R.N., Nakabeppu, Y., Fukushima, K., Fujishima, M., Herr, W.and Nishimoto, T.: "A single-point mutation in HCF causes temperature-sensitive cell-cycle arrest and disrupts VP16 function." Genes & Dev.11. 726-737 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Porter, D.W., Yakushiji, H., Nakabeppu, Y., Sekiguchi, M.Fivashh, J.Jr., Bessman, M.J.and Kasprzak, K.S.: "Sensitivity of Escherichia coli (MutT) and human (MTH1) 8-oxo-dGTPase to in vitro inhibition by carcinogenic metals ; nickel (II), copper (II), cobalt (II) and cadmium (II)" Carcinogenesis. 18. 1785-1791 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Hollen, K.M., Nakabeppu, Y.and Daviies, S.W.: "Changes in expression of DELTAFosB and the Fos family protein following NMDA receptor activation in the rat striatum." Mol.Brain Res.47. 31-42 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Taddei, F., Hayakawa, H., Bouton, M.-F., Ciriresi, A.-M., Matic, I., Sekiguchi, M.and Radman, M.: "Counteraction by MutT protein of transcriptional errors caused by oxidative damage." Science. 278. 128-130 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Yakushiji, H., Maraboeuf, F., Takahashi, M., Deng, Z.-S., Kawabata, S., Nakabeppu, Y.and Sekiguchi, M.: "Biochemical and physicochemical characterization of normal and variant forms of human MTH1 protein with antimutagenic activity." Muta.Res.384. 181-194 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Oda, H., Nakabeppu, Y., Furuichi, M.and Sekiguch, M.: "Regulation of expression of thehuman MTH1 gene encoding 8-oxo-dGTPase : Alternative splicing of transcriptiion products." J.Biol.Chem.272. 17843-17850 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Crocker, S.J., Morelli, M.Y., Nakabeppu, Y.and Robertson, G.S.: "D1-receptor-related priming is attemuated by antisense-mediated 'knockdown' of fosB expression." Mol.Brain Res.53. 69-77 (1998)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Tsuzuki, T.and Rancourt, D.E.: "Embryonic stem cell gene targeting using bacteriophage lambda vectors generated by phage-plasmid recombination." Nucl.Acids Res.(in press).
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Kawate, H., Sakumi, K., Tsuzuki, T., Nakatsuru, Y., Ishikawa, T., Takahashi, S., Takano, H., Noda, T.Sekiguchi, M.: "Separation of killing and tumorigenic effects of an alkylating agent in mice defective in two of the DNA repair genes." Proc.Natl.Acad.Sci.USA. (in press).
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Tsuzuki, T.: "Embryonic styem cell gene targeting using bacterio-phage λ vectors generated by phage-plasmid recombination." Nucleic Acids Res.(in press). (1998)
• [文献書誌] Crocker S.J.: "Dl-receptor-related priming is attenuated by antisense-mediated'knockdown'of fosB expression." Mol.Brain Res.53・. 69-77 (1998)
• [文献書誌] Taddei, F.: "Counteraction by MutT protein of transcriptional errors caused by oxidative damage." Science. 278・. 128-130 (1997)
• [文献書誌] Oda, H.: "Expression of the human MTHl gene encoding 8-oxo-dGTRase : Alternative splicing of transcription products." J.Biol.Chem.272・28. 17843-17850 (1997)
• [文献書誌] Yakushiji, H.: "Biochemical and physicochemical characterization of normal and variant forms of human MTHl protein with antimutagenic activity." Mutat.Res.384・3. 181-194 (1997)
• [文献書誌] Porter, D.W.: "Sensitivity of Escherichia coli (MutT) and human (MTHl) 8-oxo-dGTPase to in vitro inhibition by carcinogenic metals ; nickel (II),copper (II),and cadmium (II)." Carcinogenesis. 18・9. 1785-1791 (1997)
• [文献書誌] Iwakuma, T.: "High incidence of nitrosamine-induced tumorigenesis in mice lacking DNA repair methyltransferase." Carcinogenesis. 18・8. 1631-1635 (1997)
• [文献書誌] Sakumi, K: "Methylnitrosourea-induced tumorigenesis in MGMT gene knockout mice." Cancer Res.57・. 2415-2418 (1997)
• [文献書誌] Tominaga, Y.: "Alkylation-induced apoptosis of embryonic stem cells in which the gene for DNA repair methyltransferase had been disrupted by gene targeting." Carcinogenesis. 18・5. 889-896 (1997)
• [文献書誌] Goto, H.: "A single-point mutation in HCF causes temperature-sensitive cell-cycle arrest and disrupts VP16 function." Genes & Dev.11・. 726-737 (1997)
• [文献書誌] Chen, J.: "Chronic Fos-related antigens : Stable variants of ΔFosB induced in brain bu chronic treatments." J.Neurosci.17・3. 4933-4941 (1997)
• [文献書誌] Cai, J.-P.: "Significance of the conserved amino acid sequence for human MTHl protein with antimutator activity." Nucleic Acids Res.25・6. 1170-1176 (1997)
• [文献書誌] Humpphries, M.M.: "Retinopathy induced in mice by targeted disruption of the rhodopsin gene." Nature Genet.15・62. 216-219 (1997)
• [文献書誌] Igarashi, H.: "Organization and expression of the mouse MTHl gene for preventing transversion mutation." J.Biol.Chem.272・6. 3766-3772 (1997)
• [文献書誌] Rancourt, S.L.: "Murine subtilisin-like proteinases SPC6 is expressed during embryonic implantation,somatogenesis,and skeletal formation." Develop.Genet.21・. 75-81 (1997)
• [文献書誌] Hollen, K.M.: "Changes in expression of ΔFosB and the Fos family proteins following NMDA receptor activation in the rat striatum." Mol.Brain Res.47・. 31-43 (1997)
• [文献書誌] Cai,J.-P.: "Significance of the conserved amino acid sequence for human MTH1 protein with antimutator activity." Nucleic Acids Res.(in press).
• [文献書誌] Tominaga,Y.: "Alkylation-induced apoptosis of embryonic stem cells in which the gene for DNA repair methyl-transferase had been disrupted by gene targeting." Carcinogenesis. (in press).
• [文献書誌] Rancourt,S.L.: "Murine subtilisin-like proteinase SPC6 is expressed during embyonic implantation." Dev.Genet.(in press).
• [文献書誌] Humphries,M.M.: "Retinopathy induced in mice by tergeted disruption of the rhodopsin gene." Nature Genetics. 15・2. 216-220 (1997)
• [文献書誌] Igarashi,H.: "Organization and expression of the mouse MTH1 gene for preventing transversion mutation." J.Biol.Chem.272・6. 3766-3772 (1997)
• [文献書誌] Tsuzuki,T.: "Targeted disruption of the Rad51 gene leads to lethality in embryonic mice." Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 93・13. 6236-6240 (1996)
• [文献書誌] Tsuzuki,T.: "Targeted disruption of the DNA repair methyl-transferase gene renders mice hypersensitive to alkylating agent." Carcinogenesis. 17・6. 1215-1220 (1996)
• [文献書誌] Yamagata,Y.: "Three-dimensional structure of a DNA repair enzyme,3-methyladenine DNA glycosylase II,from Escherichia coli." Cell. 86・2. 311-319 (1996)
• [文献書誌] Robertson,G.S.: "Effects of olanzapine on regional c-fos expression in the rat forebrain." Neuropsychopharmacology. 14. 105-110 (1996)
• [文献書誌] Vahid-Ansari,F.: "7-OH-DPAT differentially reverses clozapine-and haloperidol-induced increases in Fos-like immunoreactivity." European J.Neuroscience. 8. 2605-2611 (1996)
• [文献書誌] Vahid-Ansari,F.: "Contrasting effects of chronic clozapin,seroquel TM and haloperidol administration on FosB-like immunoreactivity in the forebrain." European J.Neuroscience. 8. 927-936 (1996)
• [文献書誌] Doucet,J.-P.: "Chronic alterlation in dopaminergic neurotrans-mission produce a persistent elevation of ΔFosB-like protein (s) in both rodent and primate striatum." European J.Neuroscience. 8. 523-532 (1996)