生体金属による小分子の活性化

• 研究課題/領域番号: 08249102
• 研究種目: 特定領域研究(A)
• 配分区分: 補助金
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 森島 績 京都大学, 工学研究科, 教授 (50026093)
• 研究分担者: 城 宜嗣 京都大学, 理化学研究所, 副主任研究員 (70183051) ; 長谷 俊治 大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (00127276) ; 渡辺 芳人 京都大学, 分子科学研究所, 教授 (10201245) ; 郷 通子 名古屋大学, 理学部, 教授 (70037290) ; 祥雲 弘文 筑波大学, 応用生物化学系, 教授 (70012036)
• 研究期間 (年度): 1999
• 研究課題ステータス: 完了 (1999年度)
• 配分額: 164,600千円 (直接経費: 164,600千円); 1999年度: 25,700千円 (直接経費: 25,700千円); 1998年度: 38,000千円 (直接経費: 38,000千円); 1997年度: 29,600千円 (直接経費: 29,600千円); 1996年度: 71,300千円 (直接経費: 71,300千円)
• キーワード: ペルオキシターゼ / フェレドキシン / 金属蛋白質 / モジュール置換 / 亜硫酸還元酵素 / チトクロムP450

研究概要

昨年度に引き続き、森島らは、いくつかのアミノ酸置換西洋わさびペルオキシターゼ(HRP)を作製し、ペルオキシターゼ反応における近位側芳香族アミノ酸残基の役割について検討を行った。本年度は、近位側にチロシン残基を導入したHRPの2種の変異体F179Y(Phe179-〉Tyr)、F221Y(Phe221->Tyr)を作製し、プロスタグランジン合成酵素(PGHS)でみられるような反応中間体としてのチロシンラジカルが生成するかどうか検討した。その結果、Phe179位にチロシン残基を導入した変異HRPはそのESRスペクトルから、PGHSでみられるようなチロシンラジカルを生成していることが明らかになった。一方、Trpの導入でトリプトファンラジカルが生成したPhe221位では、一般に酸化され易いとされているチロシン残基を導入してもポルフィリンラジカルしか生成せず、このことは、蛋白質中のアミノ酸残基がラジカルになるかどうかは、アミノ酸固有の性質やポルフィリンからの距離だけではなく、そのアミノ酸の置かれた環境が大きく影響するものと考えられた。渡辺は、ヘム近傍のアミノ酸を置換したミオグロビンを種々のヘム酵素のモデルとして、用い、ミオグロビンにおいてもヘム周辺に適切なアミノ酸置換を行うことで、ペルオキシターゼやチトクロムP450と同様な反応中間体や触媒活性が実現できることを明らかにした。長谷は、いくつかのアミノ酸置換亜硫酸還元酵素を作製し、その基質認識機構や還元機構を検討した。城は一酸化窒素還元酵素の高分解能のX線構造解析と、そのイソシアニド複合体の可視吸収・赤外分光測定を用いて、一酸化窒素還元の分子機構を検討した。郷はペルオキシターゼなど多くの金属結合蛋白質のモジュール構造を明らかにすることにより、金属結合部位を形成する普遍的なモジュールを推定した。

研究成果

• [文献書誌] Tanaka, M., Ishimori, K., Morishima, I.: "Luminol Activity of Horseradish Peroxidase Mutants Mimicking a Proposed Binding Site for Luminaol in Arthromyces Ramosus Peroxidase"Biochemistry. 38. 10463-10473 (1999)
• [文献書誌] Furukawa, Y., Ishimori, K., Morishima, I.: "Pressure Dependence of the Intramolecular Electron Transfer Reaction in Myoglobin Reinvestigated"J. Phys. Chem. B. 104. 1817-1825 (2000)
• [文献書誌] Inaba, K., Ishimori, K., Imai,, K., Morishima, I.: "Substitution of the Heme Binding Module in Hemoglobin α- and β-subunits ? Implication for different regulation mechanism of the heme proximal structure between hemoglobin and myoglobin -"J. Biol. Chem.. 275 (印刷中). (2000)
• [文献書誌] Uchida,T.,他: "Heme Environmental Structure of CooA Is Modulated by the Target DNA Binding: Evidences from Resonance Raman Spectroscopy and CO Rebinding Kinetics" J.Biol.Chem.273. 19988-19992 (1998)
• [文献書誌] Aoki,M.,他: "NMR Studies of Putidaredoxin: Associations of Putidaredoxin with NADH-putidaredoxin reductase and Cytochrome P-450cam" Biochim.Biophys.Acta.1386. 168-178 (1998)
• [文献書誌] Morimoto,A.,他: "Detection of a Tryptophane Radical as an Intermediate Species in the Reaction of Horseradish Peroxidase Mutant (Phe-221 → Trp) and Hydrogen Peroxide" J.Biol.Chem.273. 14753-14760 (1998)
• [文献書誌] Aoki,M.,他: "Roles of Negatively Charged Surface Residues of Putidaredoxin on Interactions with Redox Partners in P450cam Monooxygenase System" Biochim.Biophys.Acta.1386. 157-167 (1998)
• [文献書誌] Aoki,M.,他: "Roles of Valine-98 and Glutamic Acid-72 of Putidaredoxin in the Electron-transfer Complexes with NADH-Putidaredoxin Reductase and P450cam" Inorg.Chim.Acta.272. 80-88 (1998)
• [文献書誌] Tanaka,M.,他: "Catalytic Roles of the Highly Conserved Glu Residue in the Heme Distal Site of Peroxidases" Biochemistry. 37. 2629-2638 (1998)
• [文献書誌] Mukai,M., Nagano,S., Tanaka,M., et al: "Effects Concerted Hydrogen Bonding of Distal Histidine on Active Site Structure of Horseradish Peroxidase ; Resonance Raman Studies with Asn-70 Mutants" J.Am.Chem.Soc.119. 1758-1766 (1997)
• [文献書誌] Tanaka,T., Ishimori,K., Morishima,I.: "The Hydrogen Bond Network in the Distal Site of Peroxidases : Spectroscopic Properties of Asn 70→Asp Horseradish Peroxidase Mutant" Biochemistry. 36. 9791-9798 (1997)
• [文献書誌] Uchida,T., Ishimori,K., Morishima,I.: "The Effects of Heme Pocket Hydrophobicity on the Ligand Binding Dynamics in Myoglobin as Studied with Leucine 29 Mutants" J.Biol.Chem.272. 30108-30114 (1997)
• [文献書誌] Tanaka,T., Ishimori,K., Morishima,I., et al: "Catalytic Activities and Structural Properties of Horseradish Peroxidase Distal His42→Glu or Gln Mutant" Biochemistry. 37. 2629-2638 (1998)
• [文献書誌] Aoki,M., Ishimori,K., Morishima,I.: "Roles of Valine-98 and Glutamic Acid-72 of Putidaredoxin in the Electron-transfer Complexes with NADH-Putidaredoxin Reductase and P450cam" Inorg.Chim.Acta.(印刷中). (1998)
• [文献書誌] Matsui,T., Ozaki,S., Watanabe,Y: "On the Formation and Reactivity of Compound I of the His-64 Myoglobin Mutants" J.Biol.Chem.272. 32735-32738 (1997)
• [文献書誌] Matsui,T: "Preparation and Reaction of Myoglobin Mutants Bearing Both Proximal Cysteine Ligand and Hydrophobic Distal Cavity : Protein Models for the Active Site of P-450" Biochemistry. 35. 13118-13124 (1996)
• [文献書誌] Nagano,S: "The Catalytic Roles of the Distal Site Asparagine-Histidine Couple in Peroxidases" Biochemistry. 35. 14251-14258 (1996)
• [文献書誌] Tanaka,M: "The Distal Glutamic Acid As Acid-Base Catalyst in the Distal Site of Horseradish Peroxidase" Biochem.Biophys.Res.Commun. 227. 393-399 (1996)
• [文献書誌] Ozaki,S.: "Conversion of Myoglobin into a Highly Stereospecific Peroxygenase by the L29H/H64L Mutation" J.Am.Chem.Soc. 118. 9784-9785 (1996)
• [文献書誌] Mukai,M.: "Effects of Concerted Hydrogen Bonding of Distal Histidine on Active Site Structure of Horseradish Peroxidase ; Resonance Raman Studies with Asn-70 Mutants" J.Am.Chem.Soc. 119(印刷中). (1997)