ジーントラップ法を用いた造血細胞分化関連遺伝子の単離

• 研究課題/領域番号: 08261221
• 研究種目: 重点領域研究
• 配分区分: 補助金
• 研究機関: 大阪府立母子保健総合医療センター・研究所
• 研究代表者: 吉田 進昭 大阪府立母子保健総合医療センター, 研究所, 部長 (10250341)
• 研究分担者: 長澤 丘司 大阪府立母子保健総合医療センター研究所, 主任研究員 (80281690)
• 研究期間 (年度): 1996
• 研究課題ステータス: 完了 (1996年度)
• 配分額: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円); 1996年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
• キーワード: ジーントラップ / ES細胞 / 造血幹細胞 / 造血細胞 / 増殖因子

研究概要

ES細胞は、in vivo、in vitroにおいて血球系細胞に分化することが知られている。op/opマウス由来の骨髄繊維芽細胞株OP-9を支持細胞としてES細胞を血球系細胞へと分化させる系が樹立されている。また、コラーゲンをコートしたディッシュ上で培養すると、ES細胞は高率に血球系・血管系の分化マーカーであるflkを発現するようになる。この2つの系を中心にして、ES細胞分化に関連する未知遺伝子の単離を試みた。
トラップベクターはEn-2イントロンの下流にスプライシングの受容シグナル、翻訳活性を上げるためのIRESシグナル、およびLacZをマーカー遺伝子として配置、下流にはアクチンプロモーター下にネオマイシン耐性遺伝子を挿入したベクターである。このベクターをES細胞株であるD3およびE14-1細胞に導入して約4000個のES細胞クローンを樹立した。これらのクローンをプールしてOP-9上で培養し、8日目にX-gal染色を行う方法でスクリーニングした。LacZを発現する陽性細胞は非常に少なく同定は困難であったが、陽性と思われる細胞を選別後、cDNAライブラリーを作成し、クローンを同定した。
約10種類のcDNAの塩基配列を決定後、未知と思われるものをプローブにして成熟マウスの各組織での発現をノザン法にて解析したが、ある程度の組織特異性はみられるものの、造血系組織で特異的に発現しているクローンは得られなかった。今後、さらなる解析を行うとともに、新規のトラップクローンの樹立を試みる。