| 研究課題/領域番号 |
08264221
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| 研究種目 |
重点領域研究
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
益谷 央豪 大阪大学, 細胞生体工学センター, 助手 (40241252)
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| 研究分担者 |
大熊 芳明 大阪大学, 細胞生体工学センター, 助教授 (70192515)
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| 研究期間 (年度) |
1996
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| 研究課題ステータス |
完了 (1996年度)
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| 配分額 *注記 |
4,500千円 (直接経費: 4,500千円)
1996年度: 4,500千円 (直接経費: 4,500千円)
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| キーワード | ヌクレオチド除去修復 / 色素性乾皮症 / XPC / HHR23B / HHR23A / TFIIH |
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| 研究概要 |
1)XP-C群細胞抽出液を分画・再構成し、XPC、HHR23B、HHR23Aの3者を、全て含まない無細胞NER系を構築した。この系では、XPC単独では低いNER活性しか示さず、HHR23Bの共存下で、XPCのNER活性が促進された。また、HHR23Bのかわりに、HHR23Aを加えても同様の効果を示した。これらのことから、XPCばかりでなくHHR23BもNERに関与していること、また、HHR23BとHHR23Aは機能的に互換性のある蛋白質であることが示された。
2)HeLa細胞より精製したXPC-HHR23B複合体は、一本鎖DNAセルロースカラムに非常に強く結合したことから、DNA結合活性を持つことが示唆された。そこで、ゲルシフト法を用いて、そのDNA結合活性について検討した。XPC-HHR23B複合体は、一本鎖および二本鎖のDNAにともに結合したが、二本鎖DNAにより強く結合した。また、紫外線を照射したDNAにより高い親和性を示したことから、DNA損傷の認識に関与していることが示唆された。
3)基本転写因子TFIIHの構成成分の一つであるp62に特異的な抗体を用いて、免疫沈降を行ったところ、ヒトのNERの正常な細胞の抽出液中よりTFIIHとともにXPCが共沈降した。精製したTFIIHとXPC-HHR23Bを用いた実験においても、抗p62抗体によりTFIIHとともにXPC-HHR23Bが共沈降した。さらに、GSTとの融合蛋白質として発現・精製したGST-HHR23Bを用いて、TFIIHとの結合について検討した結果、GST-HHR23BとTFIIHの結合は検出されなかったが、XPCの共存下では、TFIIHがGST-HHR23BおよびXPCとともに共沈降した。これらのことから、TFIIHとXPCが直接相互作用していることが示された。
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