G1/S移行期に働くRB蛋白質リン酸化酵素の解析

• 研究課題/領域番号: 08265264
• 研究種目: 重点領域研究
• 配分区分: 補助金
• 研究機関: 国立がんセンター
• 研究代表者: 田矢 洋一 国立がんセンター研究所, 生物学部, 室長 (60133641)
• 研究期間 (年度): 1996
• 研究課題ステータス: 完了 (1996年度)
• 配分額: 4,000千円 (直接経費: 4,000千円); 1996年度: 4,000千円 (直接経費: 4,000千円)
• キーワード: RB蛋白質 / サイクリンD1 / サイクリンE / サイクリンA / Cdk4 / Cdk2 / リン酸化ペプチド

研究概要

次のような成果を得た。
1.サイクリンD1-Cdk4が、他のサイクリンEやA依存性キナーゼとは異なったアミノ酸配列の所をリン酸化することを明らかにした。サイクリンD1は癌遺伝子にもなるサイクリンであるので、この発見によって、サイクリンD1が細胞癌化に関与するメカニズムの解明が大きく進展すると期待できる。
2.RB蛋白質上のSer780はサイクリンD1-Cdk4によってはリン酸化されるけれども、他のサイクリンE/A-Cdk2ではリン酸化されないサイトであることを明らかにした。このサイトはポケットBを過ぎてC末端領域に入った直後に存在する。
3.RB蛋白質上に存在する推定13箇所のリン酸化サイトを認識する抗体をすべて作製した。
このように、サイクリンEやA依存性キナーゼとサイクリンD1-Cdk4が同じ配列の所をリン酸化するという従来の説は誤りであることが本研究で明らかとなった。RB蛋白質は、サイクリンD1-Cdk4によるリン酸化で、何か特別な活性変化を来すのであろう。そのリン酸化部位をリン酸化されないアミノ酸に変えた変異体も作製できたので、サイクリンD1-Cdk4特異的リン酸化部位の生理的意義が解明されるのではないかと期待される。
また、RB蛋白質上の13カ所のリン酸化サイトを区別する抗体は、それぞれのリン酸化サイトがどのキナーゼでリン酸化されるのかということを解析するための強力な道具となるであろう。特に、ラジオアイソトープを使わずに、フォスフォペプチドマッピングも必要なく、簡単な実験でより明瞭な結果が得られることは大きなメリットである。

研究成果

• [文献書誌] Kitagawa,M.et al.: "The consensus motif for phosphorylation by cyclin D1-Cdk4 is different from that for phosphorylation by cyclin A/E-Cdk2." EMBO J. 15. 7060-7069 (1996)
• [文献書誌] Taya,Y.: "RB-kinases and RB-binding proteins : new points of view." Trends Biochem.Sci.22. 14-17 (1997)
• [文献書誌] Higashi,H.et al.: "Cyclin-dependent kinase-2 (Cdk2) forms an inactive complex with cyclin D1 since Cdk2 associated with cyclin D1 is not phosphorylated by Cdk7-cyclin H" Eur.J.Biochem.237. 460-467 (1996)
• [文献書誌] Taya,Y.et al.: "Cdk4-cyclin D1 and Cdk2-cyclin E/A phosphorylate different sites in the RB protein." Genomic Instability and Immortality in Cance. (in press).