| 研究課題/領域番号 |
08272213
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| 研究種目 |
重点領域研究
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
吉村 徹 京都大学, 化学研究所, 助教授 (70182821)
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| 研究分担者 |
栗原 達夫 京都大学, 化学研究所, 助手 (70243087)
江崎 信芳 京都大学, 化学研究所, 教授 (50135597)
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| 研究期間 (年度) |
1996
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| 研究課題ステータス |
完了 (1996年度)
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| 配分額 *注記 |
1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
1996年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
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| キーワード | アラニンラセマーゼ / 断片型酵素 / ドメイン / リフォルディング / 高次構造形成 |
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| 研究概要 |
Bacillus stearothermophilus由来の耐熱性アラニンラセマーゼ(ホモ2量体)のサブユニットは、2つのドメインから構成され、N‐末端側ドメインは、補酵素ピリドキサール5'‐リン酸(PLP)が中心に位置するTIMバレル構造をもつコア部分からなり、C‐末端側ドメインの大部分はβ鎖からなる。限定分解の結果をもとに構築した断片型遺伝子の産物(断片型酵素)は、それぞれN‐末端側、C‐末端側ドメインに相当する2つのN‐,C‐断片からなるα2β2型4量体であり、酵素学的諸性質は野性型酵素のそれとほとんど差がない。本研究では、高次構造形成とドメイン構造の関係を明らかにするため、本断片型酵素の再構成過程を解析し、その高次構造形成機構を調べた。まず変性剤存在下で断片型酵素からN‐、C‐断片を分取した。希釈法によりN‐またはC‐断片を単独で折りたたませるか、あるいは、その系に変性状態のもう一方の断片を経時的に添加した。活性回復を示標にして断片型酵素の再構成を追跡したところ、C‐断片の活性回復能は経時的に失われていくのに対し、N‐断片の活性回復能は長時間保持されることが示された。断片型酵素の再構成はPLPに依存せず、その至的適pHは10.0付近であった。このpHにおいて単独で折りたたませたN‐断片は遠紫外部にのみCDを示すこと、また、励起波長280nmにおいて変性状態の場合と異なる蛍光極大を示すことから、このN‐断片は何らかの2次構造を有し、密な構造であるが、特定の3次構造はもたないと推論された。また吸収スペクトルからPLPの結合能はないものと推察された。単独で折りたたませたN‐断片に変性C‐断片を加えた場合には、N‐断片の3次構造形成が起こり、PLP結合能が回復することから、C‐断片はN‐断片の高次構造形成を補助する機能を持つと考えられる。
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