| 研究課題/領域番号 |
08282230
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| 研究種目 |
重点領域研究
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究機関 | 大分医科大学 |
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研究代表者 |
山本 俊輔 大分医科大学, 医学部, 教授 (90040188)
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| 研究分担者 |
秋月 真一郎 大分医科大学, 医学部, 助手 (80159334)
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| 研究期間 (年度) |
1996 – 1997
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| 研究課題ステータス |
完了 (1996年度)
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| 配分額 *注記 |
3,000千円 (直接経費: 3,000千円)
1996年度: 3,000千円 (直接経費: 3,000千円)
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| キーワード | CD14 / LPS / サイトカイン / NOシンターゼ / トランスジェニックマウス / ノックアウトマウス / リコンビナント蛋白 / エンドトキシンショック |
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| 研究概要 |
1)1.ラットCD14(rCD14)cDNAの分離と一次構造の特徴:rCD14cDNAを分離した。2.rCD14および生理活性因子発現のカイネティクス検索:Kupffer細胞(KC)は他のMPS細胞とは異なるCD14およびCKの発現を示すこと、LPSによるCD14系のトリガーは少数の膜CD14により引かれること、upregulateされたCD14はLPSの清掃分子として機能すること、KCのTNF-α以外の生理活性因子遊離機能は乏しくLPSの清掃細胞として機能することなどが示唆された。2).CD14遺伝子操作マウスにおけるLPS反応性解析:1.トランスジェニックマウス(TM)の解析:1:膜型および非膜型mCD14TM:膜型および非膜型mCD14TMを作出した(M14MおよびM14S)。M14MおよびM14SではLPS(20μg/mouse)刺激後の血中TNF-αおよびIL-6レベルが有意に低値を示すこと、LPSによる致死性Shwartzman反応が有意に阻止されることなどを観察した。異所性CD14がLPS傷害に防御的に働くことやsoluble CD14にES阻止および促進の両面作用があることが示唆された。(2)mCD14N末端部アミノ酸71個をコードするTMの作出:mCD14のN末端71個のアミノ酸(N71)をコードするTMを肝に特異的に発現するTM(AT-N71)を作出した・2.mCD14ノックアウト(KO)マウスの解析:KOマウスではLPS刺激による末梢血単球からのCK産生は全く見られない。LPS投与あるいはE.coli生菌投与によるエンドトキシンショックが回避された。3).CD14系の機能と制御の解析:1.リコンビナントmCD14(rmCD14)およびトランスフェクト細胞作成と利用:N71を発現するE.coliおよびCHO-K1細胞を作成した。CHO-K1のN313 rmCD14はin vitroにおけるLPS刺激Mφ細胞株からのTNF-α遊離をdose-dependentに阻止した。functionalな抗体を得るために、E.coli由来のN71に対するウサギ抗体(pAb)を作成した。この抗体はマウスCD14全長tfCHO-K1細胞へのFITC標識LPSの結合を阻止した。また、LPSによるMφ細胞株からのTNF-αの産生を阻止した。また、上記のmCD14全長tfCHO-K1細胞をハムスターに免疫し、数系統のmAb産生細胞を得た。pAbではin vitroにおけるLPS刺激Mφ細胞株からのTNF-α遊離を阻止することを観察した。
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