| 研究課題/領域番号 |
08455382
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
生物・生体工学
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
金谷 茂則 大阪大学, 工学部, 教授 (30273585)
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| 研究分担者 |
高木 昌宏 大阪大学, 工学部, 助教授 (00183434)
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| 研究期間 (年度) |
1996 – 1997
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| 研究課題ステータス |
完了 (1997年度)
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| 配分額 *注記 |
7,000千円 (直接経費: 7,000千円)
1997年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
1996年度: 5,200千円 (直接経費: 5,200千円)
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| キーワード | 超好熱菌 / 始原菌 / 酵素 / 耐熱性 / イオンペア- / 遺伝子クローニング / グリセロールキナーゼ / リボヌクレアーゼHII / イオンペア-ネットワーク / ズブチリシン / 超好熱始原菌 / recA蛋白質 / アルパルチルtRNA合成酵素 / ATPase / DNase / クローニング / ポリアミン |
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| 研究概要 |
95℃以上の高温でも生育できる超好熱始原菌が生産する蛋白質の耐熱化機構を明らかにする目的で、様々な酵素遺伝子のクローニングを試みた。その結果、P.kodakaraensis KOD1のDNAゲノムからグリセロールキナーゼとリボヌクレアーゼHIIの遺伝子をクローニングすることに成功した。更に、酵素ではないが、Zinc finger motifを持ち転写制御に関与すると考えられるTBP結合蛋白質の遺伝子をクローニングすることにも成功した。これらの酵素の大腸菌での大量発現系を構築し、精製した後、酵素的性質や熱安定性を解析した。その結果これらの酵素は超好熱始原菌由来酵素に特徴的と考えられている性質を示すことが明らかになった。まず、これらの酵素は高い熱安定性を示すことが明らかになった。熱安定性は、酵素を含む水溶液を高温で適当な時間インキュベーションした後の残存活性を測定することにより、不可逆的な熱変性に対する安定性として解析したが、いずれの酵素も90℃の熱処理ではほとんど失活しないという結果が得られた。また、グリセロールキナーゼとリボヌクレアーゼHIIの場合、広い金属イオン要求性を示した。これらの酵素のアミノ酸組成を常温菌由来のものと比較した場合、いずれの場合も、Lys、Arg、Asp、Gluなどの荷電アミノ酸残基の含量が高いという特徴を有していた。最近、イオンペアネットワークの増強が超好熱菌由来酵素の耐熱性に寄与するという報告がいくつかなされているので、我々のクローニングした酵素も同様の機構で耐熱化されているのかもしれない。実際、大腸菌グリセロールキナーゼの結晶構造に基づいて超好熱菌グリセロールキナーゼの三次構造をモデリングしたところ、イオンペアの数は超好熱菌グリセロールキナーゼの方がはるかに多いことが示唆された。今後はこれらの酵素の三次構造の解析と耐熱化因子の同定を試みる予定である。
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