| 研究概要 |
【目的】AAV vectorを用いて5種類のヒト膵癌培養細胞株への遺伝子導入効率を比較検討した。
【方法】5種類のヒト膵癌培養細胞株(SW1990,MIAPaCa-2,Panc-1,CAPAN-2,CAPAN-1)にマーカー遺伝子としてのneo^R遺伝子を含むAAV vectorを感染させ36時間後、G418下に14日間培養した。20日目に、neo^R耐性コロニーをcountし、それらの一部のコロニーを再びG418下にexpansionした。これらよりgenomic DNAを抽出し、PCR法およびサザンブロット法にてneo^R遺伝子の有無について検討した。【結果】感染(導入)効率はSW1990 1.0×10^4CFU/ml,MIAPaCa-2 5.5×10^3CFU/ml,Panc-1 3.0×10^3CFU/ml,CAPAN-2 1.5×10^3CFU/ml,CAPAN-1 3.3×10^2CFU/mlであり、対象のHeLa細胞では4.0×10^4CFU/mlであった。対象と比較すると、25%〜0.8%の導入効率であった。G418下にて生育できる、耐性細胞にもかかわらずexpansion中にRCR法でneo^R遺伝子のbandを検出することが不可能になっており、AAVベクターがintegranteされているか否かをサザンブロット法で検出する前に、PCR法でneo^R遺伝子が、どの段階で消失するかを検討中である。また、感染高率を上昇させるために、抗ヒトCEA抗体のScFvを作製する計画であったが、別の実験系として、AAVベクターにmutant HSV(ICP6△)を同時に感染させた場合に AAVベクター単独に比べてLacZの感染発現効率を約70倍に上昇させることができたことより、現在は、mutantHSV(ICP6△)とAAVベクターとのcombination theraphyを中心に実験を行っている。
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