| 研究課題/領域番号 |
08557012
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| 研究種目 |
基盤研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 展開研究 |
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| 研究分野 |
病態医化学
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| 研究機関 | 旭川医科大学 |
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研究代表者 |
藤澤 仁 旭川医科大学, 医学部, 教授 (10027039)
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| 研究分担者 |
石田 敦彦 旭川医科大学, 医学部, 助手 (90212886)
亀下 勇 旭川医科大学, 医学部, 助教授 (60127941)
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| 研究期間 (年度) |
1996 – 1997
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| 研究課題ステータス |
完了 (1997年度)
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| 配分額 *注記 |
19,000千円 (直接経費: 19,000千円)
1997年度: 12,400千円 (直接経費: 12,400千円)
1996年度: 6,600千円 (直接経費: 6,600千円)
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| キーワード | ゲル電気泳動法 / アッセイ方法 / 蛋白質燐酸化酵素 / 蛋白質脱燐酸化酵素 / 合成基質ペプチド / シグナル伝達 / 蛋白質燐酸化反応 / 蛋白質脱燐酸化反応 |
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| 研究概要 |
1.合成オリゴペプチドを基質に用いた電気泳動ゲル内蛋白質燐酸化酵素の検出法の開発と応用
我々が1989年に報告した電気泳動ゲル内蛋白質燐酸化酵素検出法に合成オリゴペプチドを蛋白質燐酸化酵素の基質として用いる方法を検討し、本検出法の汎用化を目指した。合成オリゴペプチドは単独ではゲル内に固定できないが、ポリリジンに共有結合させると効率よく固定され、蛋白質燐酸化酵素の基質となる特異配列が認識されることが明らかになった。この方法を用いてMAPキナーゼによって燐酸化されるミエリン塩基蛋白質の燐酸化部位周辺のアミノ酸配列を持つ合成ペプチドをゲル内に固定し、細胞の粗抽出液中のMAPキナーゼ活性を特異的にかつ、高感度で検出できることを確認した。
2.電気泳動ゲル内蛋白質脱燐酸化酵素の検出法の開発と応用
ポリリジンに結合させた合成オリゴペプチドを蛋白質燐酸化酵素で燐酸化した後、ゲル内に固定して蛋白質脱燐酸化酵素を検出する方法を開発した。この方法を用いてCaMキナーゼIIの自己燐酸化部位周辺のアミノ酸配列を持つ合成ペプチドをCaMキナーゼIIで燐酸化した後ゲル内に固定し、ラットの脳の粗抽出液中の脱燐酸化酵素をスクリーニングした。CaMキナーゼIIの自己燐酸化部位を特異的に脱燐酸化する新しい蛋白質脱燐酸化酵素が検出されたので、この脱燐酸化活性を追跡しながらラットの脳からCaMキナーゼII脱燐酸化酵素を純粋に精製し、その性質を明らかにした。
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