高親和性可溶性TCRおよびMHC/ペプチド複合体による選択的免疫制御法の開発

• 研究課題/領域番号: 08557026
• 研究種目: 基盤研究(A)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 展開研究
• 研究分野: 免疫学
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 笹月 健彦 九州大学, 生体防御医学研究所, 教授 (50014121)
• 研究分担者: 福井 宣規 九州大学, 生体防御医学研究所, 助教授 (60243961) ; 上川路 信博 (上川路 信彦) 九州大学, 生体防御医学研究所, 助教授 (90224659)
• 研究期間 (年度): 1996 – 1998
• 研究課題ステータス: 完了 (1998年度)
• 配分額: 12,000千円 (直接経費: 12,000千円); 1998年度: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円); 1997年度: 2,500千円 (直接経費: 2,500千円); 1996年度: 7,500千円 (直接経費: 7,500千円)
• キーワード: 可溶性TCR / 可溶性MHC / ペプチド複合体(3) / ロイシンジッパー / 解離定数 / 親和性 / ペプチド複合体 / MHC / GPIアンカー / PI-PLC / 高親和性 / Leucin Zipper

研究概要

従来、抗原特異的CD4陽性T細胞は、in vitroで抗原及び抗原提示細胞とサイトカインの存在下で培養することにより樹立されてきた。しかしながら、この方法では、その頻度を正確に評価することは困難であり、またサイトカインの影響によりT細胞の機能に偏りが生じる可能性がある。これらの問題を克服するために、可溶性四量体MHCクラス II/ペプチド複合体の開発を試みた。対象としたMHCクラス II分子であるI-A^b分子は、細胞外ドメインのみで発現されると十分量のヘテロダイマーが回収できない。これは、1つにα鎖、β鎖の会合不全によると考えられる。そのため、それぞれのC端にロイシンジッパー構造のアミノ酸配列を導入し、また結合ペプチド(Eα)をI-Aβ鎖に共有結合させるという工夫を行った。さらに、一方のロイシンジッパー配列のC端にシステイン残基をコードするようにした。このコンストラクトをバキュロウイルスベクターを用いて昆虫細胞で発現、精製した後、遊離システインを特異的にビオチン化し、これをストレプトアビジンと架橋することで可溶性四量体MHCクラスII/ペプチド複合体を樹立した。この分子は抗原特異的CD4陽性T細胞株をフローサイトメトリーにて直接検出し得た。
さらに同様の方法を用いてI-A^b/Eαペプチド複合体を特異的に認識する可溶性T細胞受容体(N3-5LZ)を作成した。BIAcoreを用いたI-A^b/Eαペプチド複合体とN3-5LZの結合動態の解析において、ストレプトアビジンセンサーチップ上でビオチン化N3-5LZの四量体を形成させると、単量体を固相化した時に比べ著明な解離時間の延長を認め、その親和性は約300倍上昇した。
以上multivalent可溶性TCRおよびMHC/ペプチド複合体を樹立し、各々のリガンドを直接同定単離する方法論を確立した。この方法論は今後T細胞分化、自己免疫、移植免疫あるいは癌免疫といったさまざまな分野で応用可能であると考えられる。

研究成果

• [文献書誌] Nishimura H.: "MHC class II-dependent NK1.1+γβT cell are induced in mice by Salmonella infection." J.Immunol.in press. (1999)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Gyotoku T.: "An endogenously processed self peptide and the coresponding exogenous peptide bound to the same MHC class II molecule could be distinct ligands for TCR with different kinetic stability." Eur.J.Immunol.28. 4050-4061 (1998)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Fukui Y.: "Highly restricted T cell repertoire shaped by a single major histocompatibility complex-peptide ligand in the presence of a single rearranged T cell recepter β chain." J.Exp.Med.188. 897-907 (1998)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Gapin L.: "Quantitative analysis of the T-cell repertoire by a single peptide/MHC complex." J.Exp.Med.187. 1871-1883 (1998)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Fukui Y.: "Positive and negative CD4+ thymocyte selection by a single MHC class II/peptide liqand affected by its expression level in the thymus." Immunity. 6. 401-410 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Nishimura H,et al: "MHC class II-dependent NK1.1^+gammadeltaT cells are induced in mice by Salmonella infection." J.Immunol.(in press). (1999)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Gyotoku T.et al.: "An endogenously processed self peptide and the corresponding exogenous peptide bound to the same MHC class II molecule could be distinct ligands for TCR with different kinetic stability." Eur.J.Immunol.28. 4050-4061 (1998)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Fukui Y,et al.: "Highly restricted T cell repertoire shped by a single major histocompatibility complex-peptide ligand in the presence of a single rearranged T cell receptor beta chain." J.Exp.Med.188. 897-907 (1998)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Gapin L,et al.: "Quantitative analysis of the T-cell repertoire by a single peptide/MHC complex." J.Exp.Med.187. 1871-1883 (1998)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Fukui Y,et al.: "Positive and negative CD4^+ thymocyte selection by a single MHC class II/peptide ligand affected by its expression level in the thymus." Immunity. 6. 401-410 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Nishimura H.: "MHC class II-dependent NK1,1+γδ T cells are induc ed in mice by Salmonella infection." J.Immunol.(in press). (1999)
• [文献書誌] Gyotoku T.: "An endogenously processed self peptide and the corresponding exogenous peputide bound to the same MHC class II molecule could be distinct ligands for TCR with di fferent kinetic stability." Eur.J.Immunol.28. 4050-4061 (1998)
• [文献書誌] Fukui Y.: "Highly restricted T cell repertoire shaped by a single major histocompatibility complex-peptide ligand inthe presence of a single rearranged T cell receptor β chain." J.Exp.Med.188. 897-907 (1998)
• [文献書誌] Gapin L.: "Quantitaive analysis of the T-cell repertoire by a single peptide/MHC complex." J.Exp.Med.187. 1871-1883 (1998)
• [文献書誌] Savoie,CJ.: "MHC class I bound peptides of a colon carcinoma cell line,a Ki-ras gene-targeted progeny cell line and a B cell line." Cancer Letters. (in press).
• [文献書誌] Tana T.: "A HLA binding motif-aided peptide epitope library:A novel library design for the screening of HLA-DR4-restricted antigenic peptides ecognized by CD4 T cells" J.Human Genet.(in press).
• [文献書誌] Ohmori M.: "Activated Ki-ras enhances sensitivity of ceramide-induced apoptosis without c-Jun NH2-terminal kinase/stress-activated protein kinase or extracellular signal-regulated kinase activation in human colon cancer cells." Cancer Research. vol.57. 4714-4717 (1997)
• [文献書誌] Kimura A.: "Mutations in the cardiac troponin I gene associated with hypertrophic cardiomyopathy." Nature Genet.vol.16. 379-382 (1997)
• [文献書誌] Furuse M.: "Suppression of serum-induced c-jun expression by activated Ki-ras in human colon cancer cells." Jpn.J.Human Genet.vol.42. 409-416 (1997)
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• [文献書誌] Fukui Y.: "Differential requirement of MHC class II molecules expressed on hematopoietic cells for positive selection of CD4+ thymocytes in TCRab and TCRb transgenic mice." Int.Immunol.vol.9. 1385-1391 (1997)
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• [文献書誌] Fukui Y.: "Positive and negative CD4+ thymocyte selection by a single MHC class II/peptide ligand affected by its expression level in the thymus." Immunity. vol.6. 401-410 (1997)
• [文献書誌] Takeshita T.: "Identification of HLA-DQ6-derived peptide recognized by mouse MHC class I H-2Db-restricted CD8+ T cells in HLA-DQ6 transgenic mice." Jpn.J.Human Genet.vol.42. 225-232 (1997)
• [文献書誌] Fukui Y.: "Positive and negative CD4_+ thymocyte selection by a single MHC class II/peptide ligand in vivo affected by its expression level in the thymus." Immunity. (in press).
• [文献書誌] Takeshita T.: "Identification of HLA-DQ6-derived peptide recognized by mouse MHC class I H-2D^b-restricted CD8_+ T cells in HLA-DQ6 transgenic mice" Jpn.J.Human Genet.(in press).
• [文献書誌] Hori T.: "Japanese cedar pollinosis and HLA-DP5." Tissue Antigens. 47. 485-491 (1996)
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• [文献書誌] Date Y.: "DNA typing of the HLA-A gene:population studay and identification of four new alleles in Japanese." Tissue Antigens. 47. 93-101 (1996)
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