| 研究課題/領域番号 |
08650951
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
生物・生体工学
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
野原 大輔 名古屋市立大学, 薬学部, 助教授 (60080214)
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| 研究分担者 |
栗本 英治 名古屋市立大学, 薬学部, 助手 (90234575)
黒田 良孝 名古屋市立大学, 薬学部, 講師 (40080204)
酒井 朝也 名古屋市立大学, 薬学部, 教授 (00080169)
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| 研究期間 (年度) |
1996 – 1998
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| 研究課題ステータス |
完了 (1998年度)
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| 配分額 *注記 |
2,200千円 (直接経費: 2,200千円)
1998年度: 500千円 (直接経費: 500千円)
1997年度: 500千円 (直接経費: 500千円)
1996年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
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| キーワード | タンパク質 / リフォールディング / 固定化法 |
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| 研究概要 |
(1) アガロースゲルにsubtilisin BPN'をアミノ基あるいはカルボキシル基で固定化した2種類の固定化subtilisinを調製し、定量的なrefoldingのできるサンプルを得た。この標品を用いて様々な種類のrefolding溶液による再生操作を行い、有効性を評価した。その結果、固定化法の種類によらずsubtilisinのrefoldingには高濃度の酢酸カリウムなどの有機酸塩が大変有効であることがわかった。固定化法の種類によらず同様の結果を示したことにより固定化法というものがrefolding溶液選定のための有効な手段であることが明らかとなった。
(2) 同じくプロテアーゼであるthermolysinを固定化したものも調製し、これによるrefolding溶液の評価を行ったところ、若干の違いはあるもののsubtilisinの場合とよく似た結果が得られた。こうした高濃度の有機酸塩はlysozymeなどの再生には全く効果はない。
(3) 次に、分子内にS-S結合を含むStreptomyces griseus由来のtrypsin(SGT)についてはアガロースゲルに固定化したものは、変性還元、再生操作を繰り返すたびに固定化SGTの活性回復率は低下していき、subtilisinやthermolysinの場合のように定量的refoldingができなかった。アガロースゲルの代わりにガラスビーズを用いてSGTを固定化すると、変性還元、再生操作を繰り返しても定量的refoldingが可能となり、refolding溶媒の定量的評価に使えることとなった。
(4) 固定化ベンザミジンをSGTのrefolding系に共存させた場合、タンパク質濃度が0.25μg/mlのとき、非共存の場合と比べて5割程度refolding収率が上昇した。
(5) とくに、固定化べンザミジンをSGTのrefolding系に共存させて収率が大幅に上昇したことは、カラム操作等による念願の連続的、大量処理のrefolding系の設計が可能となったと思われる。
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