| 研究課題/領域番号 |
08660106
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用微生物学・応用生物化学
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
鈴木 秀之 京都大学, 農学研究科, 助手 (10202136)
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| 研究期間 (年度) |
1996 – 1997
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| 研究課題ステータス |
完了 (1997年度)
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| 配分額 *注記 |
2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
1997年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
1996年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
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| キーワード | γ-グルタミルトランスペプチダーゼ / γ-グルタミルトランスフェラーゼ / グルタチオン / プロセッシング / 部位特異的突然変異 / 翻訳後修飾 / γ-グルタミルトランスペプチターゼ |
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| 研究概要 |
γ-グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子(ggt)は、SD配列に続き、25アミノ酸よりなるシグナルペプチド、365アミノ酸よりなる大サブユニット、190アミノ酸よりなる小サブユニットが1つのORFの中にコードされている珍しい構造をとっており、大腸菌のγ-グルタミルトランスペプチダーゼ(GGT)は哺乳類のGGTと同様、1本のポリペプチド鎖として合成された後、大小2つのサブユニットにプロセスされると考えられた。塩基配列から求めた各サブユニットの分子量は精製したGGTの各サブユニットのイオンスプレーマススペクトルより求めた分子量と良く一致し、プロセッシングの過程でアミノ酸残基の欠落が起こっていないことがわかった。大腸菌のGGTはGln-390とThr-391の間がポストトランスレ-ショナリーに切断されて、マチュアーな酵素タンパクになると考えられた。そこで、部位特異的変異法により切断点付近のアミノ酸配列の重要性を検討したところ、Thr-391とHis-393の2つの残基がプロセッシングにクリティカルであることを見出した。これらの残基の変異株は大小サブユニットにプロセスしていない未成熟な酵素タンパクを蓄積し、酵素活性を持たなかった。これに対して、Gln-390はそれほど重要ではないことが分かった。一方、切断箇所から遠く離れたArg-513とArg-571をAlaやGlyに置き換えた変異株でもプロセッシングが起こらないことを見出した。特にArg-571はC末端から10残基目であることから、プロセッシングは翻訳が終了し、タンパクのコンフォメーションがある程度できあがってから起こるのではないかと考えられた。同様なポストトランスレ-ショナリーなプロセッシングを受けるペニシリンアシラーゼ(後述するN-terminal nucleophile hydrolasesの一種)においてもC末端の重要性が報告されており、このことからも両者が類似の機構によってプロセッシングされることが示唆された。最近、プリカーサーがプロセッシングを受けて成熟し、しかもB鎖のN末アミノ酸残基の側鎖が酵素の活性中心(カルボニル炭素をアタックする求核原子)であることが知られている3つのアミドヒドロラーゼの活性中心付近の立体構造が酷似していることが分かり、構造上のスーパーファミリーとしてN-terminal nucleophile hydrolasesと呼ぶことが提唱されている。これらの酵素は何枚かのβ-シートがすのこ状に2組平行に存在している共通の構造を取っていることが分かっており、プロセッシング機構はオートプロセッシングによるのではないかと考えられている。大腸菌のGGTのX線構造解析を行いリボンモデルを作ったところとN-terminal nucleophile hydrolasesと同様、何枚かのβ-sheetsがすのこ状に2組平行に存在している共通の構造を取っていることが分かり、GGTもN-terminal nucleophile hydrolasesに属するのではないかと考えられ、GGTのプロセッシングもautoprocessingによるのではないかと考えられた。
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