| 研究課題/領域番号 |
08660401
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
生物資源科学
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| 研究機関 | 宮崎大学 |
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研究代表者 |
太田 一良 宮崎大学, 農学部, 助教授 (70112315)
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| 研究分担者 |
中村 豊彦 宮崎大学, 農学部, 教授 (90040857)
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| 研究期間 (年度) |
1996 – 1997
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| 研究課題ステータス |
完了 (1997年度)
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| 配分額 *注記 |
2,200千円 (直接経費: 2,200千円)
1997年度: 500千円 (直接経費: 500千円)
1996年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
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| キーワード | Aspergillus niger / Penicillium sp. / イヌリナーゼ / イヌリン / イヌロオリゴ糖 / エタノール / キクイモ / 遺伝子クローニング / 塩基配列 / Saccharomyces cerevisiae / 並行複発酵 |
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| 研究概要 |
1.イヌリンを貯蔵多糖として含有するキクイモから回分式の並行複発酵によりエタノールを生産した。宮崎県えびの市産のキクイモから調製した乾燥粉末をイヌリナーゼ高生産性変異株Aspergillus niger817の液体培養150mlと混合し、エタノール耐性を示す酵母Saccharomyces cerevisiae1200を10^8cells/mlとなるように接種後、30℃で発酵させた。15および24時間発酵後さらに30gと20gのキクイモ乾燥粉末をそれぞれ追加した結果、120時間で20.1%(v/v)の高濃度エタノールを生成した。
2.イヌリナーゼ高生産性糸状菌TN-88株を大分県の土壌中から分離、選出し、ペニシリウム属と同定した。本菌株から精製したエンド型イヌリナーゼの分子量は6.8kDa、比活性は105U/mgであり、pH5.2、50℃で最大活性を示した。イヌリンに特異的に作用し、スクロース、ラフィノース、レバンには作用しなかった。また、イヌリンに対して70%の分解限度を示し、その主要な加水分解産物は、イヌロトリオースであった。イヌリン(平均分子量、6,000)に対するKm値は0.20mMであった。N末端アミノ酸配列は、1-DDYRPAFHFC PAENXMNENP GLIQIXSTXH-30であった。
野生株A.niger No.12が細胞外に生産するエンド型イヌリナーゼの内部アミノ酸配列を基に合成した2種のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRでエンド型イヌリナーゼ遺伝子の一部(648bp)を増幅した。このPCR産物をプローブとしてゲノムDNAライブラリー(pUC18)から516個のアミノ酸をコードするエンド型イヌリナーゼ遺伝子のOpen reading frameを含む3.9kbpと5.9kbpのEcoRI断片を単離した。本遺伝子には介在配列は認められず、23個のアミノ酸からなるシグナルペプチドと6ヶ所のN-グリコシド型糖鎖結合部位が推定された。また、本酵素遺伝子を導入した大腸菌の無細胞抽出液でイヌリナーゼ活性が認められた。さらに、Penicillium purpurogenum起源の同酵素と72%の相同性を示した。
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