| 研究概要 |
Epstein-Barrウイルス産生状態においては複製開始領域Ori Lytから複製は始まり少なくとも複製後期にはローリングサークル型複製様式によりウイルスゲノムは複製され複製間体としてhead-to-tail concatemerが合成される。研究目的はこのローリングサークル型DNA合成機構を明らかにすることであり、複製フォークで働く蛋白質の個々の機能及び相互作用を解析することにある。このウイルスゲノム複製伸長を担うウイルス蛋白質としてBALF5蛋白質、BMRF1蛋白質、BALF2蛋白質、BBLF4蛋白質、BBSLF1蛋白質、BBLF2/3蛋白質が知られている。これまでBALF5蛋白質がPolymerase catalytic subunit,BMRF1蛋白質がPolymerase accessory subunitであることを明らかにしてきた。平成8年度においてはBALF2蛋白質について解析した。BALF2遺伝子をウイルスDNAからクローニングし大腸菌で発現させBALF2蛋白質精製し、兎に注射してこうBALF2蛋白質抗体を作成した。この抗体を用いたウエスタンブロット法によりEBV産生Bリンパ球よりBALF2蛋白質を各種カラムを通して精製した。精製されたBALF2蛋白質は、MW130kであり一本鎖DNA結合活性をもっていた。primed M13 ssDNAをtemplate-primerとしてEBVDNAポリメラーゼ複合体によるDNA合成系ではBALF2蛋白質はtemplate上に形成される二次構造を解消するように働きDNAポリメラーゼがtemplate上を動きやすくなるように働くことが推定された。BALF2蛋白質は一本鎖DNA結合蛋白質として働くことを明らかにした(Virology 222:352-364,1996)。次にEBVDNAポリメラーゼ複合体には弱いながらStrand displacement DNA合成活性があることを見つけた。primed M13 ssDNA系にEBVDNAポリメラーゼ複合体をいれるとFull lengthより長いDNAが合成されることが確認された。mung bean nuclease処理により生成産物の長さは7.2kbにまで削られた。また,ATP,ATPγ-Sによってstrand displacement活性は影響されなかった。EBV DNA polホロ酵素のcatalyticサブユニットであるBALF5蛋白質,アクセサリーサブユニットのBMRF1蛋白質をin vitroで再構成させた場合もEBV DNA polホロ酵素の場合とほぼ同様の結果が得られた。この結果は現在投稿中である。
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