| 研究課題/領域番号 |
08670362
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
免疫学
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
松本 良二 東京大学, 医科学研究所, 助手 (20272495)
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| 研究期間 (年度) |
1996
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| 研究課題ステータス |
完了 (1996年度)
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| 配分額 *注記 |
2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
1996年度: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
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| キーワード | マスト細胞 / 中性セリンプロテアーゼ / トリプターゼ / mMCP-7 / バキュロウィルス / Ser-Glycinプロテオグリカン |
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| 研究概要 |
マウスマスト細胞プロテアーゼの一つであるトリプターゼmMCP-7(mouse mast cell protease-7)をバキュロウィルス/昆虫細胞を用いてリコンビナントタンパクとして発現させたところ、シグナルペプチドが切断されたプロ酵素として昆虫細胞培地中に大量に分泌されることがわかった。精製を容易にするため、無タンパク培地であるINSECT-Xpressに適応させたタンパク高産生細胞High Five細胞に発現させたところ、さらに一層の大量発現がみられ、その培養上清からヘパリンカラムのみで精製することができた。また、プロペプチドを切断する酵素は見つかっていないので、プロペプチドと成熟酵素の間に遺伝子工学の力を借りてエンテロキナーゼ切断部位を挿入し、さらに精製を容易にするために、カルボキシ末端にフラッグペプチドをつけ加えた。抗フラッグ抗体カラムで精製したこのmMCP-7にエンテロキナーゼを加えて培養し、活性mMCP-7を得ることが出来た。この活性mMCP-7は強いトリプターゼ活性を示し、どのようなペプチドを切断するのか調べてみた。その結果ある配列を切ることがわかりその検索によって生理的基質と思われるタンパクが浮上してきた。実際そのタンパクを活性mMCP-7に加えると切断されることがわかった。以上のことは現在投稿中である。
一方、マスト細胞プロテアーゼの顆粒内安定化に必須と思われるSer-Glycinプロテオグリカンの遺伝子ノックアウトに関しては、129マウスジェノミックライブラリーより作製したターゲッティングベクターをES細胞にトランスフェクトした後、ジフテリア毒素でネガティブセレクション、ジェネティシン耐性にてポジティブセレクションを行い、約300クローンを第二エクソンをプローブとしてジェノミックサザンブロッティングを試みた。しかし、相同組み替えとランダムインテグレイションの区別が非常につきにくいことがわかった。これは、プローブの検出感度に問題があることがわかり、違ったプローブ(既に作製済み)を用いて、スクリーニングを再びやる予定である。
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