| 研究課題/領域番号 |
08670908
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
小児科学
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| 研究機関 | 奈良県立医科大学 |
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研究代表者 |
田中 一郎 奈良県立医科大学, 医学部, 講師 (00201616)
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| 研究分担者 |
中 宏之 奈良県立医科大学, 医学部, 助手 (40281761)
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| 研究期間 (年度) |
1996 – 1997
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| 研究課題ステータス |
完了 (1997年度)
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| 配分額 *注記 |
2,200千円 (直接経費: 2,200千円)
1997年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
1996年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
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| キーワード | 第VIII因子 / サブユニット / 遺伝子治療 / 遺伝子発現 / ヒト第四因子 / イヌ第四因子 / 血友病犬 / cross-reactivity |
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| 研究概要 |
第VIII因子cDNAのうちH鎖およびL鎖に相当する約2kbのcDNAをそれぞれ作成し、発現ベクターpNeoIG502に別々に組み込んだ後、CHO(Chinese Hamster Ovary)細胞に遺伝子導入し、H鎖およびL鎖の各サブユニットを発現させた。発現した第VIII因子サブユニットを培養上清中でCaCl_2もしくはMnCl_2の存在下で再構成させた後、凝固1段法および合成発色基質法にて第VIII因子活性を、抗ヒト第VIII因子モノクローナル抗体を用いたサブユニット特異ELISA(Emzyme-linked immunosorbentassay)により第VIII因子抗原量を測定した。それによると、L鎖サブユニットは0.02〜0.04U/mlとわずかながら発現が認められたが、H鎖サブユニットの発現および第VIII因子凝固活性は全く認められなかった。そのため遺伝子導入効率がより優れているとおもわれるアデノウイルスベクターに変更しCHO細胞を標的細胞として再度発現実験を行った。その結果、培養上清中のL鎖サブユニットは0.1〜0.2U/mlの発現が認められたが、H鎖サブユニットの発現および第VIII因子凝固活性はほとんど認められなかった。
現在、使用するベクターをレトロウイルスベクターやアデノ関連ウイルスベクターに、標的細胞をヘパトーマ細胞(HepG2)や皮膚線維芽細胞、マウス筋芽細胞に変更し、遺伝子導入効率、導入遺伝子の安定性および遺伝子発現効率について検討中である。
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