ヒトGHRH受容体遺伝子の構造とその発現調節機構の解析

• 研究課題/領域番号: 08671159
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 内分泌・代謝学
• 研究機関: 神戸大学
• 研究代表者: 置村 康彦 神戸大学, 医学部・附属病院, 助手 (30204100)
• 研究分担者: 千原 和夫 神戸大学, 医学部, 教授 (00107955)
• 研究期間 (年度): 1996
• 研究課題ステータス: 完了 (1996年度)
• 配分額: 2,400千円 (直接経費: 2,400千円); 1996年度: 2,400千円 (直接経費: 2,400千円)
• キーワード: GHRH受容体遺伝子 / Pit-1 / 転写調節 / 成長ホルモン / 下垂体

研究概要

1.ヒト成長ホルモン放出ホルモン受容体(GHRHR)遺伝子のクローニング
既知のGHRHR遺伝子のコーディング領域に続くGHRHR遺伝子5'上流配列(約6k)をクローニングし、翻訳開始点より2.7kまでのシークエンスをした。さらに、ヒト下垂体mRNAを用いて、primer extension法、RNase protection法により転写開始点の決定を試みた。その結果、翻訳開始点より130bp上流が主な転写開始点と考えられた。5'RACE法を使用して、5'非翻訳領域を増幅したところ、翻訳開始点より130bp上流まで伸びた。そのフラグメントのシークエンスを行ったところ、その塩基配列はクローニングしたGHRHR遺伝子の翻訳開始点の上流とまったく一致しており、既知のGHRHR遺伝子のコーディング領域の上流には未知のイントロンはなく、130bp上流が転写開始点と考えられた。このGHRHR遺伝子5'上流配列には典型的なTATAboxはなかったが、GHおよびPRL産生細胞特異的な転写因子であるPit-1の結合配列様塩基配列が9箇所認められた。
2.ルシフェラーゼアッセイによるGHRHR遺伝子5'上流配列の機能解析
上記のGHRHR遺伝子5'上流配列を順次、切断し、それぞれにルシフェラーゼ遺伝子を結合させたレポーター遺伝子を作製した。これをGH、PRLを産生するGH_3細胞(GHRHRは下垂体GH産生細胞に発現しているため、この細胞株を用いた)にトランスフェクトした後、GH_3細胞のルシフェラーゼ活性を測定した。この結果、翻訳開始点から14lbp上流までデリーションしたときは、活性が保たれているが、90bpまでデリーションしたときには、活性が著減することが明らかになった。この結果はGHRHR遺伝子の構造解析成績とよく合致した。一方、GH_3細胞で活性を発揮するレポーター遺伝子をCos細胞およびHela細胞にトランスフェクトしたときには、ルシフェラーゼ活性は全く検出し得なかった。しかし、同時にPit-1 を発現させてみると、ルシフェラーゼ活性は明らかに検出され、Pit-1 がGHRHR遺伝子の組織特異的発現を規定することが明らかになった。