| 研究課題/領域番号 |
08671174
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
内分泌・代謝学
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
城谷 哲也 熊本大学, 医学部・附属病院, 助手 (30274715)
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| 研究分担者 |
宮村 信博 熊本大学, 医学部・附属病院, 助手 (40274716)
荒木 栄一 熊本大学, 医学部・附属病院, 講師 (10253733)
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| 研究期間 (年度) |
1996 – 1997
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| 研究課題ステータス |
完了 (1997年度)
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| 配分額 *注記 |
2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
1997年度: 200千円 (直接経費: 200千円)
1996年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
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| キーワード | インスリン遺伝子プロモーター / IPF1 / A3 element / protein kinase C / 転写因子 / EMSA / CAT assay / TAAT配列 |
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| 研究概要 |
本研究では、以下の1〜4を行った。
1.ヒトインスリン遺伝子プロモーターのグルコース反応領域の解析
CAT assayにより、ヒトインスリン遺伝子のグルコース反応領域が転写開始部位より上流のA3 element(TAAT配列)を含む-230から-200bpの約30bpに存在することを決定した。
2.グルコース反応領域に結合する転写因子の解析
・-230から-200bpの合成oligo(プローブ)と、この領域内のTAATをTCCTに変異させたプローブを用いたEMSAにより、TAAT配列のA3 elementに結合したC1とC2のバンドを認めた。さらに、UV crosslink assayを行い、このC1、C2のバンドを形成する転写因子の分子量は、約36、48kDaであることが判明した。
・A elementのTAAT配列に結合する転写因子のinsulin promoter factorl(IPF1)の抗体を合成ペプチド用いて作成し、同抗体を用いたEMSAにて、C2のバンドを形成する 転写因子はIPF1、C1のバンドを形成する転写因子はdegradated IPF1又はIPF1の類似蛋白であることが示唆された。
3.A3 element(TAAT配列)に結合する転写因子の機能解析
酸フオスファターゼ処理した核蛋白を用いたEMSAにより、C1、C2のバンドが非処理バンドに比べTAAT配列への結合能が減少していることを確認し、転写因子のリン酸化が結合能に関与していることが示唆された。
4.IPF1のリン酸化アミノ酸の同定とprotein kinaseの機能解析
・各抗ホスホタイロシン、ホスホセリン、ホスホスレオニン抗体を用いて、各グルコース濃度培養下の核蛋白とのウエスタンブロットを行った結果、高グルコースではIPF1のスレオニンのリン酸化が有意に増加していた。
・各種のprotein kinaseを用いたin vitro phosphorylation assayにて、このスレオニンのリン酸化を調節しているのは、protein kinase Cの可能性が示唆された。
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