細胞間接着を介した口腔癌および口腔粘膜上皮細胞の増殖機構の解析

• 研究課題/領域番号: 08672314
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 外科系歯学
• 研究機関: 徳島大学
• 研究代表者: 布袋屋 智朗 徳島大学, 歯学部・附属病院, 助手 (10274234)
• 研究分担者: 中野 孝三郎 徳島大学, 歯学部・附属病院, 助手 (20274235) ; 倉郷 貴敏 徳島大学, 歯学部・附属病院, 助手 (10263857)
• 研究期間 (年度): 1996
• 研究課題ステータス: 完了 (1996年度)
• 配分額: 2,200千円 (直接経費: 2,200千円); 1996年度: 2,200千円 (直接経費: 2,200千円)
• キーワード: Amphiregulin / EGFセレプター / 抗体作製 / 口腔癌 / 口腔粘膜上皮細胞

研究概要

われわれは、口腔癌においてEGFレセプター過剰発現が高頻度に起こっており、その原因が癌遺伝子c-erbB-1の遺伝子増幅やレセプター分子の分解の遅延にあることを報告してきた。また、口腔癌および口腔粘膜上皮細胞においてEGFレセプターのリガンドであるTGF-α、HB-EGFおよびAmphiregulinが強く発現していることを見い出している。本研究では、入手困難なHB-EGFおよびAmphiregulinに対する特異抗体を作製し、この特異抗体を用いることにより、口腔癌および口腔粘膜上皮細胞に発現しているEGFレセプターの生理的なリガンドと考えられるHB-EGFおよびAmphiregulinの存在様式やその発現量を蛋白レベルで解明できると考えられる。そこで今回はAmphiregulinに対する特異抗体の作製を行った。
はじめに、MBS法にてAmphiregulinの細胞外ドメインで、ヘパリン結合ドメインおよび核移行シグナルを含む部分に対応するペプチド(アミノ酸配列:V-K-P-P-Q-D-K-T-E-S-E-N-T-S-D-K-P-K-R(19残基))を作製した。次に、合成したポリペプチドをHPLC(高速液体クロマトグラフィー)を用いて精製した後、ペプチドのC末端に存在するcys残基を利用してキャリア蛋白(KIH)とコンジュゲートを作製した。コンジュゲートをフロインドのアジュバンドとともにうさぎ2羽に免疫することにより、ペプチドに対する抗血清を作製した。抗血清は、ELISA法を用いて測定したところ、十分な力値が得られており、Amphiregulinに対するポリクローナル抗体とした。今後、ポリクローナル抗体を合成ペプチドを用いてアフィニティー精製を行い、これを用いて口腔癌および口腔粘膜上皮細胞におけるAmphiregulinの発現量を調べ、口腔癌や口腔粘膜疾患における上皮細胞の増殖とEGFレセプターとそのリガンドとの関連性を解析していく予定である。