| 研究課題/領域番号 |
08672601
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用薬理学・医療系薬学
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| 研究機関 | 秋田大学 |
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研究代表者 |
伊藤 邦彦 秋田大学, 医学部, 助教授 (90221770)
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| 研究分担者 |
水柿 道直 東北大学, 医学部, 教授 (60004595)
鈴木 敏夫 秋田大学, 医学部, 教授 (20108559)
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| 研究期間 (年度) |
1996 – 1997
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| 研究課題ステータス |
完了 (1997年度)
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| 配分額 *注記 |
2,200千円 (直接経費: 2,200千円)
1997年度: 700千円 (直接経費: 700千円)
1996年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
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| キーワード | ファージディスプレイ / ヒト型抗体 / コンビナトリアルライブラリー / ロタウイルス / ファージディスプレイシステム |
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| 研究概要 |
ファージディスプレイ法によるヒト型抗体作製法の確立およびその臨床応用を目的として、小児下痢症の原因ウイルスであるロタウイルスに対するヒト型モノクローナル抗体の作製を行い、得られたクローンについて詳細な解析を行ったので以下に報告する。
ロタウイルスに対して高い抗体価を有する健常人(ON、AO)より採取した末梢血リンパ球RNAより、RT-PCR法を用いて抗体遺伝子を増幅後、ファージディスプレイベクターpComb3に挿入し、IgG_1、κライブラリーを構築した。ライブラリーサイズは、ON;2.5x10^7cfu、AO;4.0x10^6cfuであった。作製したFab提示型ファージライブラリーに対してロタウイルスを抗原とした5ラウンドのパニングを行った。これにより抗原結合性ファージのタイタ-は、約30倍に上昇した。最終ラウンドのパニング後に、可溶性Fab発現型に変換したファージミドDNAを持つ大腸菌クローンを、培養して得られた可溶性Fabのロタウイルスに対する反応性を、サンドイッチELISA法により検討し、ONライブラリーより21個、AOライブラリーより10個の陽性クローンを得た。さらに、得られたクローンの異同をBstNIフィンガープリンティングにより確認し、最終的にONライブラリーより5個、AOライブラリーより3個のクローンを得ることに成功した。これらすべてのFabクローンは、ロタウイルスWa株と濃度依存的に反応し、また、自己あるいは非自己抗原に対して交差反応性を示さず、ロタウイルス特異的であることが明らかとなった。次に、FabクローンにH鎖およびL鎖可変部のヌクレオチド配列を決定し、データベースに報告されているシークエンスとの相同性を解析した結果、、同一ライブラリーから得られたクローンは、単一のジャームラインに由来するH鎖配列を有し、ONライブラリーより得られたクローンは、V_H4ファミリーに属し、AOライブラリーより得られたクローンは、V_H3ファミリーに属することが明らかとなった。それに対して、L鎖のシークエンスにおいては多様性が認められた。さらには、各種ロタウイルス株(Wa、AU-1、AU-64、RRV)との反応性について検討した結果、ONライブラリーより得られたクローンは、すべての株に対して同程度の反応性を示したのに対して、AOライブラリーより得られたクローンは、Waに対して選択性を示した。最後に、これらのクローンの認識する抗原分子を、イムノブロット法により解析した結果、ロタウイルス内殻の構成タクパク質であるVP6を認識していることが明らかとなった。しかしながら、先述の結果を考えあわせれば、両ライブラリーより得られたFabクローンは、VP6の異なるエピトープを認識しているものと考えられた。以上の結果より、ファージディスプレイ法を用いることにより、簡便に高い特異性を有するヒト型抗体の作製が可能であることが明らかとなった。また、本研究で得られたFabクローンは、各種生体試料中からのロタウイルスの検出あるいは同定などの臨床検査分野への応用が可能であることが明らかとなった。
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