| 研究概要 |
平成8年度は主に化学発光反応の高感度化とバイオリアクターを用いた化学発光FIA法による血清3-ヒドロキシ酪酸(3-HBA)測定法に関する研究を行った。無脈流ポンプの採用,フローセルの改良,光がチューブを伝わって外部から入らないようにする工夫などにより,過酸化水素の検出感度を約0.1μmol/μl(試料)まで上昇させることができた。3-HBA測定に関しては,3-HBA脱水素酵素(3-HBADH)とNADHオキシダーゼ(NOX)の固定化時の重量比が5:1のカラムが3-HBA測定において最も有効に作用した。同時固定化3-HBADH/NOXカラムは1.5mMまでのNADHと3-HBAをほとんどすべて分解し,3-HBAの検量線も直線性を示し,さらに重層や混合HBADH/NOXカラムと比べて約2倍の発光強度を示した。この原因は同時固定化カラムだと,3-HBADHとNOXが非常に近接して存在しているために,それら2つの酵素反応が非常に効率よく進行したためであると考えられる。
平成9年度は同法を用いて1,5-アンヒドログルシトール(1,5-AG)の迅速高感度分析法の開発に関する研究を行った。ピラノースオキシダーゼ(PROD)は1,5-AGのみでなくグルコースも酸化分解して過酸化水素を生成する。PRODの1,5-AGに対する反応速度はグルコースに対するよりも非常に遅いが、カラムだと非常に多くのPRODを含むため、1,5-AGの分解率はグルコースの分解率の約70%まで大きく上昇した。血清グルコース除去のために同時固定化グルコキナーゼ(GK)/ピルビン酸キナーゼ(PK)カラムを用いると、GKはグルコースのみでなく1,5-AGをも、その反応速度はグルコースに比べると非常に遅いが、リン酸化した。血清1,5-AG測定に最も有用なカラムは、GK1000U、PK0.28mlを固定化して作製された同時固定化GK/PKカラムで、これに試料1μlを注入すると、試料中のグルコースの99.99%が除去された。このカラムによる血清1,5-AGの測定結果も良好であった。
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