| 研究課題/領域番号 |
08680666
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
構造生物化学
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| 研究機関 | 産業医科大学 (1997)
産業医科大学医療技術短期大学 (1996) |
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研究代表者 |
三砂 將裕 産業医科大学, 産業保健学部, 助教授 (30157474)
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| 研究分担者 |
江藤 澄哉 産業医科大学, 医学部, 教授 (90010347)
塚田 順一 産業医科大学, 医学部, 助手 (20227367)
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| 研究期間 (年度) |
1996 – 1997
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| 研究課題ステータス |
完了 (1997年度)
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| 配分額 *注記 |
2,500千円 (直接経費: 2,500千円)
1997年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
1996年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
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| キーワード | アスパラギン結合型糖鎖 / N-グリカン / アルファマンノシダーゼII / アルファマンノシダーゼII^X / プロモーター / アルファマンノシダーゼII^x |
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| 研究概要 |
1.ヒトα-mannosidase II^X(α-MII^X)の基質特異性の解析
ヒトα-MII^Xの基質特異性を検討するために、まず酵母をホストとして遺伝子組換え型α-MII^Xを作成した。本酵素は合成基質mannopyranosideに対する活性を有し、スワンソニンで阻害されないことが判明し、Nグリカンの合成過程に関わる酵素の一つであると考えられた。更に、基質としてピリジルアミノ(PA)化オリゴ糖を用いて検討では、α-MII^Xは、α-mannosidase II(α-MII)と異なる基質特異性を有することが示唆され、現在、この点に関して詳細に検討中である。
2.α-MII及びα-MII^Xの蛋白レベルでの発現の解析
α-MII及びα-MII^XのcDNAを組み込んだ発現ベクターをCOS-1細胞に同時発現させ、これらの蛋白の細胞局在部位をα-MII^Xに対する抗血清を用いて蛍光免疫染色法にて同定した。いずれの蛋白もmedian Golgiに局在することが判明した。
3.ヒトα-MII^X遺伝子のプロモーター領域の解析
ヒトα-MII^X遺伝子のプロモーター領域を含む約40kbpのcosmidクローンを解析した。このクローンは1139個のアミノ酸からなるα-MII^X蛋白のうち396個のアミノ酸をコードする8つのエクソンを含んでいた。転写開始点の5'領域にはTATA boxやCAAT boxを含まずGCに富み、6つのSp1コンセンサス配列を持ち、house keeping geneの特徴を有した。5'上流域の種々の断片をLuciferase vectorに組み込み、ヒト由来細胞にtransfectionし、プロモーター部位を解析したところ、-12から+11にプロモーター活性が認められ、-4300から-252にエンハンサー活性が認められた(Eur J Biochem,242:446-453,1996)。更に、α-MII^X遺伝子の5'上流域にはインターフェロン、GM-CSF等に応答する転写因子結合部位が認められており、これら免疫性サイトカインにより実際にα-MII^X遺伝子プロモーターが働き得るか否かを検討予定している。
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