| 研究課題/領域番号 |
08680695
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
機能生物化学
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
片山 勉 九州大学, 薬学部, 助手 (70264059)
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| 研究期間 (年度) |
1996 – 1997
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| 研究課題ステータス |
完了 (1997年度)
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| 配分額 *注記 |
2,400千円 (直接経費: 2,400千円)
1997年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
1996年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
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| キーワード | DNA複製 / ヌクレオチド結合 / タンパク質 / 細胞同期 / 細胞周期 / DnaA / 大量精製 / アフィニティー・ラベル / ATP結合部位 |
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| 研究概要 |
目的:DnaA蛋白質はATP/ADPと高親和性で結合する。ATP結合型には複製開始活性があるが、ADP結合型は不活性である。本研究の第1の目的は、ATP結合部位をアミノ酸レベルで同定し、蛋白質構造変化の機構を明らかにすることである。特に、ATPのガンマ位リン酸が相互作用するアミノ酸の同定は、蛋白質活性化の機構を知るために最も重要である。第2の目的は、DnaA蛋白質の複製開始能およびその制御に必要なドメインの同定である。このために、複製開始が過剰に起こり致死性を示すようになったdnaA遺伝子変異株を分離しその蛋白質を生化学的に解析する。
結果:ATPのガンマ位のリン酸修飾体を用いたアフィニティー・ラベル法により、415位のリジン残基がATPのガンマ位のリン酸と特異的に相互作用することが示唆された。次に、部位特異的変異導入法によって、この残基を他のアミノ酸と置換した変異体を作成し、その蛋白質を精製した。その結果、このアミノ酸が、ATPによる蛋白質活性化に必須であることが示された(投稿準備中)。一方、ランダム変異導入法によって、致死性を示すdnaA変異株を3種得ることができた。変異はいずれもDnaA蛋白質のATP結合ドメインとDNA結合ドメインの間の狭い領域に限定されていた。さらに、うち1種の変異体蛋白質は、ATPとの結合能を失っているにもかかわらず、複製開始能は保持していた。以上の結果は、この領域の構造がDnaA蛋白質の機能制御に重要であることを示し、蛋白質の構造機能相関を知る上で重要な知見である。
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