筋由来運動ニューロン栄養因子cDNAのマスタープレートからのクローニング

• 研究課題/領域番号: 08680900
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 神経・筋肉生理学
• 研究機関: 岡崎国立共同研究機構
• 研究代表者: 樫原 康博 岡崎国立共同研究機構, 生理学研究所, 助手 (00161018)
• 研究期間 (年度): 1996
• 研究課題ステータス: 完了 (1996年度)
• 配分額: 1,900千円 (直接経費: 1,900千円); 1996年度: 1,900千円 (直接経費: 1,900千円)
• キーワード: 運動ニューロン / 栄養因子 / クローニング / 筋 / ニワトリ胚 / 自然細胞死 / cDNAライブラリー / アフリカツメガエル卵母細胞

研究概要

運動ニューロンの存在は、その支配標的器官である筋由来の栄養因子に存在する事が古くより仮定されているが、その実体は不明である。我々は、この分子のcDNAをクローニングする目的で、鶏胚下肢筋から得られたmRNAよりcDNAライブラリーを作成した。このライブラリーcDNAを1万pfuずつに分画し、それぞれの分画cDNAより作成したcRNAを、アフリカツメガエル卵母細胞に注入することで得られる翻訳分泌タンパクを自然細胞死期の鶏胚運動ニューロンに投与したところ無投与群に比べて有意にその生存が促進される分画を見いだした。そこで、これを3000pfuに希釈した分画を10個作り、その中に活性cDNAを有するファージが存在するかを同様の方法で検定した。生存活性の比較的強い分画をさらに1000pfu希釈したところ、生存を促進する分画とむしろ生存を抑制する分画を偶然得た。そこで我々は、生存促進分画とこの抑制分画の両者を並列してクローニングすることに決定した。それぞれを上記希釈法で分画し、最終的に両者とも200pfuまでに絞った。希釈法による分画方法では必ずしも活性cDNAを有するファージが分画に存在するとは限らないが、ファージの種類が多い場合はこの方法を採らざるをえない。しかし200pfuまで絞られたので、次に示す確実に活性cDNAファージは拾えるマスタープレート法に切り替えた。先ず、生存抑制因子を先に単一cDNA化する目的で、この分画のファージを150pfuずつ10個の寒天プレート(マスタープレート)に撒き、それぞれの活性cDNAファージの有無を検討し、強力に生存抑制を有するプレートを特定できた。そこで、この150pfuの寒天プレートのコロニーを1個づつ取り出し、各々を増殖させストックした。現在この単一cDNAを有するファージをグループ分けし、各々の活性を検討するという作業を繰り返しているところである。