インゲンマメへの遺伝子導入系を用いたタンパク質分解系発現機構の解析

• 研究課題/領域番号: 08740624
• 研究種目: 奨励研究(A)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 植物生理
• 研究機関: 東京都立大学
• 研究代表者: 山内 大輔 東京都立大学, 理学部, 助手 (40220222)
• 研究期間 (年度): 1996
• 研究課題ステータス: 完了 (1996年度)
• 配分額: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円); 1996年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
• キーワード: 種子発芽 / 遺伝子発現 / 形質転換 / 貯蔵物質分解 / プロテアーゼ / DNA結合タンパク質 / マメ科植物 / 分子生物学

研究概要

インゲンマメ発芽種子での貯蔵タンパク質分解に主要な働きを担うシステインプロテアーゼEP-C1についてその遺伝子発現の解析を進めるために形質転換インゲンマメの作製を試みた。また、この遺伝子5'上流域に結合するタンパク質の検出を行い、新たな知見を得た。
1、インゲンマメ形質転換体の作製:ここでは遺伝子発現を解析する際に必要なレポーター遺伝子について、これまでに用いていたβ-グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子以外に発光クラゲの発光タンパク質GFP遺伝子の利用について検討した。その結果、インゲンマメ発芽子葉の傷で紫外線照射により発光を示したことから、GFPはこの研究目的には適さないことが示された。したがって、EP-C1遺伝子5'上流域にGUS遺伝子を融合したものをTiプラスミドベクターpBIN19に組み換えて、それをインゲンマメの胚軸の頂芽の部分に粒子銃で撃ち込み、形質転換体を得ることを試みた。ポリメラーゼ連鎖反応法により導入遺伝子の検出を行ったところ、およそ100個体中で1個体に導入遺伝子が検出された。しかし、この個体を鉢に移植する際に失敗した。この系の実用化にはこの移植における工夫が必要であることがわかった。
2、DNA結合タンパク質検出:EP-C1遺伝子の5'上流域を4つに断片化し、これらに結合するタンパク質が存在することをゲル移動度シフト法によって明らかにしているが、競合実験の結果、こららはすべて同じタンパク質であることが示唆された。しかし、フットプリント法によってその結合配列を決定することはできなかった。