| 研究課題/領域番号 |
08750932
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| 研究種目 |
奨励研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
生物・生体工学
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| 研究機関 | 早稲田大学 |
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研究代表者 |
桐村 光太郎 早稲田大学, 理工学部, 助教授 (90195412)
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| 研究期間 (年度) |
1996
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| 研究課題ステータス |
完了 (1996年度)
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| 配分額 *注記 |
1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
1996年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
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| キーワード | Aspergillus niger / アンチマイシンA / 遺伝子工学 / クロコウジカビ / シアン非感受性呼吸 / ミトコンドリア |
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| 研究概要 |
Aspergillus niger(クロコウジカビ)のシアン非感受性呼吸系は、シアンやアンチマイシンAに非感受性でサリチルヒドロキサム酸に感受性を示す。このような呼吸系を構成する酵素はalternative oxidaseと呼ばれているが、一部の植物と真核微生物のものを除いて当該酵素の性質や遺伝子構成は不明である。本研究においては、A.nigerのシアン非感受性呼吸系酵素の遺伝子レベルでの存在の実証を目的として、alternative oxidaseをコードする相補DNA(以下cDNAと略)を取得し塩基配列を決定した。さらに、当該cDNAを大腸菌で発現させた。シアン非感受性呼吸活性が強く現れるような条件下で培養したA.nigerの菌体よりメッセンジャーRNAを抽出し、これに逆転写酵素を作用させてcDNAライブラリーを作成した。植物で塩基配列が決定されているalternative oxidase遺伝子の保存配列を調べ、相当するDNAプローブを合成してcDNAライブラリーよりA.niger alternative oxidaseをコードするcDNAを取得した。当該cDNAは1053bpから成り分子量約39kDaのタンパク質をコードすることが判明した。植物のそれとは塩基レベルで約50%、アミノ酸レベルで約70%の相同性を示した。当該cDNAより予想されるタンパク質のN末端付近にはミトコンドリア移行シグナルが存在した。つぎに、IPTGの存在下で発現が誘導される発現ベクターpkk223-3に当該cDNAを組込み、大腸菌DH5αを形質転換した。このキメラプラスミドを有する形質転換体にはIPTGの誘導条件下でシアンやアンチマイシンAに非感受性でサリチルヒドロキサム酸に感受性を示す呼吸が出現した。
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