| 研究課題/領域番号 |
08760070
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| 研究種目 |
奨励研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
応用微生物学・応用生物化学
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
足立 博之 東京大学, 大学院・総合文化研究科, 助手 (00211699)
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| 研究期間 (年度) |
1996
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| 研究課題ステータス |
完了 (1996年度)
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| 配分額 *注記 |
1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
1996年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
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| キーワード | ペニシリン / ペニシリン結合蛋白質 / β-ラクタマーゼ / 分子進化 / 触媒機構 / アシル酵素 / 蛋白質工学 |
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| 研究概要 |
本研究は、ペニシリンの標的であるペニシリン結合タンパク質(PBP2)とペニシリン分解酵素のβ-ラクタマーゼの構造の類似性に着目して、PBP2にin vivoまたはin vitroで変異を導入して発現させ、ペニシリン耐性で選択してPBP2からβ-ラクタマーゼを進化させることを目的とした。変異位置を同定し、タンパク質の三次構造と対応させることで、標的と分解をわける機構の解明ができるはずである。in vivoでは、強烈なmutator大腸菌中、プラスミド上のPBP2に変異を導入し、世代時間ごとに、細胞より分離した変異PBP2ライブラリを野生型の大腸菌に導入したが、この方法では耐性株は得られなかった。一方、プラスミドを持つmutatorを世代時間ごとにそのままペニシリンで選択すると、プラスミドを導入してから3日目以降の細胞からは最大50μg/mlという高いペニシリンに対して耐性を示すものが得られた。しかし、その株からプラスミドを分離して、野生株に再導入しても耐性を示すものは得られなかった。細胞の中でプラスミドがヘテロになっている可能性が考えられ、さらに高い頻度の形質転換法を検討する必要がある。一方、in vitroでは、Taq polymeraseのerrorを用いる方法を検討したところ、宝社のExTaqでPCRを行うと約400塩基に一回の変異がランダムに導入されることがわかった。この変異遺伝子断片ライブラリをプラスミドにクローニングしてペニシリンで選択中であるが、現在のところクローンは得られていない。1アミノ酸置換のみでは目的のクローンが得られない可能性があり、現在error率を強制的にあげてクローンを選択中である。おそらく、数アミノ酸の置換でクローンが得られると考えており、PCR法を中心にさらにスクリーニングを続けることで目的のクローンが得られるものと考えている。
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