| 研究課題/領域番号 |
08770062
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| 研究種目 |
奨励研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
薬理学一般
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
大見 和宏 東京大学, 医学部, 助手 (90251214)
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| 研究期間 (年度) |
1996
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| 研究課題ステータス |
完了 (1996年度)
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| 配分額 *注記 |
1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
1996年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
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| キーワード | 平滑筋 / 分化制御 / bHLH / クローニング |
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| 研究概要 |
平滑筋細胞の分化制御機構解明を目標に、私は平滑筋としての分化形質を有する培養株化細胞の開発に成功した。本研究ではこの細胞を利用して種々の細胞分化調節遺伝子構造の中に共通に見い出されるbHLH配列を有する遺伝子の検索を行った。
*成果
1bHLH遺伝子検索用プローブの作製
2平滑筋の分化形質を有する培養株化細胞を用いてのcDNA遺伝子ライブラリー作製
株化細胞からオリゴ(dt)セルロースカラムによるmRNAの調製、mRNAからGubler&Hoffmannの方法に従いcDNAの合成、ラムだgt11ベクターへの連結、パッケージングの過程を経てcDNAライブラリーを作製した。
3bHLH遺伝子検索用プローブの標識及びcDNAライブラリーのスクリーニング
1で作製したプローブをランダムプライム法を用いて蛍光標識をし、2で作製したライブラリーのファージを大腸菌に感染させ寒天培地上にプラークを形成させた。各々のプラークDNAをニトロセルロース膜へと転写した。標識プローブとハイブリダイゼーションを行った。
4目的遺伝子のクローニングとBluescriptベクターへのサブクローニング
3で反応が得られたプラークのDNAを用いたサザンプロット法により、bHLH構造を含むことが確認されたクローンのみを用いて同様に二次、三次スクリーニングを行った。そしてクローニングされた各cDNAクローンをBluescriptベクターにサブクローニングした。
以上のように平成8年度の本研究でbHLH遺伝子のクローニングに成功した。今後はこの遺伝子の構造、機能の解析を進める。
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