| 研究課題/領域番号 |
08770221
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| 研究種目 |
奨励研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
ウイルス学
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| 研究機関 | 自治医科大学 |
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研究代表者 |
卜部 匡司 自治医科大学, 医学部, 助手 (40213516)
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| 研究期間 (年度) |
1996
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| 研究課題ステータス |
完了 (1996年度)
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| 配分額 *注記 |
1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
1996年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
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| キーワード | アデノ随伴ウイルス / Rep蛋白質 / 部位特異的遺伝子導入 / AAVS1領域 |
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| 研究概要 |
アデノ随伴ウイルスのコンポーネントであるRep蛋白質とITR配列を利用しての第19番染色体AAVS1領域への部位特異的外来性遺伝子導入法を確立するため、4種類あるRep蛋白質(Rep78、68、52、40)のうちどれがAAVS1への特異的組込み活性を持つか調べた。個々のRepを単独で発現するプラスミドと、ITR配列で挟んだネオマイシン耐性遺伝子(Neo^r)発現ユニットを持つプラスミドを作製し、それらを同時に293細胞にトランスフェクトし、AAVS1領域へのNeo^rプラスミドの特異的組込みの有無をPCRを応用した検出法により検討した。その結果、Rep78、68がAAVS1への組込み活性を持つことを明らかにした。さらに、トランスフェクトした細胞をG418で選択を行い、コロニーを形成させ、個々のクローンをサザンブロット法、FISHにてNeo^rの19番染色体AAVS1領域への組込みの有無を解析した。コントロールとしてRepプラスミドの代わりにブランクベクターを用いた場合、10クローン解析したうち、AAVS1領域への組込みを示したクローンはなかったが、Rep78、68を用いた場合それぞれ4/10、1/8に部位特異的組込みが認められた。つまりRep78の方がRep68より、より部位特異的にNeo^rを組み込むことが判った。今後は、さらに部位特異的組込み効率を上げるため、過剰に発現させると細胞毒性を示すRep蛋白質の発現量を調節するシステムを導入し、より安全性の高い染色体DNAへの部位特異的組み込み法を確立したい。
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