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1.upstreamATGの点変異遺伝子作成:
ラット・アンジオテンシンtype 1A受容体(AT_<1A>R)遺伝子エクソン1に存在するshort open reading frame(sORF)の開始コドンであるATG(upsteam ATG)の点変異をPCR法により作成。sORFを含んだ201bpのPCR産物を後述のCATレポーター遺伝子およびAT_<1A>A cDNAの5'上流に組み換え、発現プラスミドを得た。この際、実験の対照として、同領域の野生型の組み換え体も用意した。
2.upstreamATG変異のAT_<1A>R発現に及ぼす効果:
1)CAT発現系による評価…p201CAT(野生型)及びp201mCAT(変異型)をラット血管平滑筋(A10)細胞にリン酸カルシウム法により導入。導入した細胞のCAT活性を求め、並行して抽出した全RNAからCATmRNAレベルの変化を定量、比較した。結果、upstreamATGの点変異はCAT活性を約2.6倍に増加させたが、CATmRNAレベルには差を認めなかった。
2)AT_<1A>R発現系による評価…pcAT_<1A>R(野生型)及びpcAT_<1A>Rm(変異型)をCos-7細胞に1)と同様に導入。発現したAT_<1A>R蛋白をウエスタン・ブロット法により定量すると変異型では野生型に比し、約2.5倍に増加した。しかし、AT_<1A>R mRNAレベルには変化を認めなかった。
3.合成sORFペプチドのAT_<1A>R発現に及ぼす効果:
上述のsORFによりコードされる11アミノ酸からなるペプチドを合成し、pcAT_<1A>Rmを鋳型としたreticulocytelysateによるin vitro転写・翻訳系の反応液中に添加。0〜30μmol/Lの同ペプチドは、AT_<1A>R蛋白産生量を濃度依存性に非添加群の24%まで抑制した。
以上の結果は、ラットAT_<1A>RのupstreamATGより始まるsORFが、AT_<1A>R蛋白翻訳に抑制効果を有する可能性を示唆するものと考えられる。
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