甲状腺ホルモン核受容体の転写発現調節因子のクローニングと機能解析

• 研究課題/領域番号: 08770813
• 研究種目: 奨励研究(A)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 内分泌・代謝学
• 研究機関: 信州大学
• 研究代表者: 鈴木 悟 信州大学, 医学部, 助手 (30222061)
• 研究期間 (年度): 1996
• 研究課題ステータス: 完了 (1996年度)
• 配分額: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円); 1996年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
• キーワード: 甲状腺 / 核受容体 / 転写因子 / プロモーター / クローニング

研究概要

甲状腺ホルモン核受容体のプロモーター配列1300塩基対を、4つに分けてPCRで増幅後、300〜400塩基対のフラグメントを得た。片側の末端をDNAポリメラーゼと^<32>P-dCTPで標識し、成熟ラット肝核抽出液を用いフットプリントを行った結果、10カ所の部位で蛋白質の結合が確認された。先に報告された転写開始起点に、最近位のGCボックスは、その他4カ所のGCボックスと異なり、プロモーター全体の転写活性に、重要な役割を担っている。最近位のGCボックスを含む約20塩基対の配列に結合する蛋白質を成熟ラット脳のcDNAライブラリーを用い現在クローニングを進めている。結合部位のうち、-913〜-904の部位は、POU転写因子の結合配列と相同の部位であった。成熟ラット脳、肝、腎、心、脾、精巣の核抽出液を用い、ゲルシフトを行ったところ、単一のバンドが得られた。ラット脳核抽出液を、胎生19日、生直後2時間、24時間、2日、6日から得、同様のゲルシフトを行ったところ、胎生期と生直後のバンドはいずれも1本であったが、バンドの移動度に変化を認めた。この配列に結合する蛋白のDNA配列に対する親和性をスキャッチャード解析したところ、成熟ラットのそれぞれの臓器の核抽出液は、ほぼ同様の親和性を示したが、胎生期の蛋白は、成熟ラットの親和性よりも高く、異種のものである可能性が考えられた。現在、ラット脳の胎生期、及び成熟ラット脳のcDNAライブラリーを用い、サウスウエスタン法によりこれらの蛋白のクローニングを行っている。