| 研究概要 |
今回polymerase chain reaction(PCR)を用いたサブトラクションクローニング法を新たに開発し、膵B細胞株を用いグルコースにより発現が制御される遺伝子の単離、同定および解析を行なった。
(方法)高グルコースあるいは低グルコース下にて培養したMIN6細胞からcDNA poolを作成した。各々のcDNA poolを我々が新たに開発したPCRを用いたsubtraction法により高グルコースあるいは低グルコースで遺伝子発現に差を認める遺伝子の単離に成功した。得られたcDNAはsubcloning後、ABI 373 sequencerを用い塩基配列を決定した。クローニングされた遺伝子のDNA配列はBLAST programを用いGenbank,EMBLの遺伝子とhomology searchを行なった。
(結果)高グルコースのcDNA poolから19の独立した遺伝子が検出された。既知遺伝子としてprealbumin,IAPP,ublquinoneoxidoreductaseの3種が検出された。これら遺伝子の発現の過剰はNorthern法およびRT-PCR法にて確認した。ほかにhuman ESTのhomologueが2種、残りはこれまでの遺伝子とはhomologyのない遺伝子であった。低グルコースのcDNA poolから11の独立した遺伝子が検出された。そのうち既知遺伝子としてintracisternal A particleとXPB/ERCC遺伝子および2種のmouse ESTが検出された。human ESTのhomologueは2種で残りはこれまでの遺伝子とはhomologyのない遺伝子であった。
(考察)今回開発したPCR法を用いたサブトラクションクローニング法は、効率よく簡便に、発現の異なる遺伝子を単離することが可能である。今回膵B細胞株より単離同定されたグルコースにより発現が制御される遺伝子をさらに解析することで、膵B細胞におけるインスリン分泌機構を解明し、さらにこれらの遺伝子はNIDDM発症との関連を検討することにより糖尿病発症遺伝子の候補となりうる可能性がある。
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