| 研究課題/領域番号 |
08770875
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| 研究種目 |
奨励研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
腎臓内科学
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| 研究機関 | (財)癌研究会 |
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研究代表者 |
花井 順一 財団法人癌研究會, 癌研究所・生化学部, 研究員 (70261964)
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| 研究期間 (年度) |
1996
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| 研究課題ステータス |
完了 (1996年度)
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| 配分額 *注記 |
1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
1996年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
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| キーワード | 腎尿細管 / ターゲッテング機構 / 極性 / ナトリウム / 水素イオン交換輸送蛋白 / LLC-PK1細胞 / antisense oligonucleotide / PCRクローニング / アミロライド |
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| 研究概要 |
腎尿細管における輸送担体のターゲッテング機構を解明するために、輸送担体としてナトリウム/水素イオン交換輸送蛋白(Na/H exchanger : NHE)を、モデル上皮としてLLC-PK1 細胞を用いて、NHEのアイソフォーム(NHE-1,NHE-3)の上皮細胞における局在を分子生物学的手法により解析した。
1。透過性のあるフィルター膜上にLLC-PK1細胞をconfluentに培養し、上皮側、基底側それぞれのNa^+依存性の細胞内pH上昇(NHE活性)を、HCO_3^-のない条件で測定した。この結果LLC-PK1細胞においては上皮側、基底膜側にアミロライドに対する感受性が異なるNHE活性が存在することが判明した。
2。上皮側にNHE-1が混入している可能性を明らかにする目的でLLC-PK1細胞のNHE-1 mRNAに対するantisense oligonucleotideを用いて、上皮側、基底膜側のNHE活性の抑制を検討した。NHE-1 cDNAの5'末端の配列に対するantisenseを用いると基底膜側のNHE活性のみが抑制されることが判明した。以上からLLC-PK1細胞においてはNHE-1は基底膜側にのみ分布しているものと考えられた。この事実はJournal of Cellular Physiology誌に発表した(in press)。
3。すでにクローニングされているラットとラビットのNHE-3に共通して保存されている部分をprimerとしてLLC-PK1細胞のNHE-3 cDNAのPCRクローニングしている。得られたNHE-3 cDNA cloneを、作成したNHE欠損fibroblastに発現させ機能を検討し、また得られたcDNA cloneに対するantisenseを作成し、上記と同様の機能抑制の有無からNHE-3のLLC-PK1細胞における分布を確認している。
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