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1. pp65 truncated recombinant vaccinia virusの樹立
CMVの核マトリックスタンパクであるpp65をN末端より100アミノ酸ごと制限酵素でtrucationしたmutation formを作り、vaccinia virusのvectorであるpSC11MCSにligateし種々のrVacをhomologous recombinationで樹立した。full length (606)-pp65rVac、458 (Not I site)-pp65 rVac、383 (Hind III site)-pp65 rVac、316 (Sma I site)-pp65 rVac、225 (BstEII site)-pp65rVac、 122 (BsrBI site)-pp65 rVac、0-pp65 rVacを樹立し、必要に応じさらに細かい範囲のrVacを樹立した。また、T7tag認識sequenceを組み込んで、樹立したrVacのタンパク発現をT7tag抗体を用いWestern Blotting法で確認した。
2. HLA class I拘束性CMV pp65特異的CTLクローンの樹立
CMVはfibroblastには感染するが、T細胞には感染しない特性を利用し、CMVを感染させた自己のfibroblastを刺激細胞として用い、CMV特異的CTLを誘導した後、CMV pp65特異的CTLを樹立した。樹立したCTLクローンが、CMV pp65特異的か否かを、full length pp65 rVacに感染した自己のEBV immortalized cell (LCL)を標的細胞としてクローム遊離試験(CRA)で決定し、同様にHLA class I拘束性をfull length pp65 rVacに感染した種々のLCLに対する障害活性および抗HLA class I抗体によるblocking assayにて、HLA B35拘束性pp65特異的CTLクローンをの樹立に成功した。
3. ペプタイドのmapping
樹立したCTLクローンを用い、1.で樹立した各種のpp65 truncated rVacを感染した自己のLCLを標的細胞としてCRAを施行した。pp65のC末端から数えて122番目の範囲内に存在することを解明した。
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