| 研究概要 |
1.骨芽細胞培養系(ROS17/2.8骨芽細胞様細胞)にTGF-β(1ng/ml)を添加後,RNAを抽出し,ノーザンブロットを行った結果,TGF-βは添加3時間後より骨シアロタンパク質(BSP)のmRNAの発現を増加させ,12時間後にはコントロールの約8倍にまで促進した.また,TGF-βの効果がmRNAの安定性に関与するかどうかを,RNA合成阻害剤を用いて検討したところ,TGF-βは安定性には影響しないことが明らかになった.
2.TGF-β刺激および無刺激ROS17/2.8細胞より核を抽出し,TGF-βによりBSPの転写速度に変化が生じているかどうかをランオンアッセイにて検索したところ,約2倍に促進されていることが明らかとなった.
3.ルシフェラーゼベクターに,種々の長さに調節したプロモーター遺伝子を挿入し,骨芽細胞様細胞(ROS17/2.8cells)の中へDEAE-dextran法にてトランスフェクションを行い,TGF-βで刺激したところ,BSPのプロモーター約500bp上流を含むコンストラクトでルシフェラーゼ活性の上昇が認められた.BSPプロモーター約500bp上流にはヌクレアファクター1結合部位(NF-1)に類似した配列が存在し,その配列の合成DNAをルシフェラーゼアッセイ時にコトランスフェクションしたところ活性の上昇が抑制された.以上の結果より,BSPプロ-モーター中のNF-1に類似した配列(TAE;TGF-β activation elementと名付けた)を介してTGF-βによる転写の調節が行われていると考えられた.
4.BSPプロモーター中のTAE配列をアイソトープで標識し,ゲルシフトアッセイにて核内タンパク質との結合性の検索を行った結果,TGF-β刺激によりROS17/2.8細胞の核内にTAEに結合する転写因子が合成され,その結果BSPの転写が促進されることが明らかになった.
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