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1.高度好熱菌の遺伝子操作系の改良
高度好熱菌のためのインテグレーションベクターの改良を行い、それを用いて耐熱性の低い大腸菌由来イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(IPMDH)を高度好熱菌内で発現させることに成功した。このベクターを用いると開始コドンをあわせることによりどのような遺伝子も染色体に挿入可能となり、多くの酵素の進化工学的耐熱化を可能とした。また、ピリミジン合成系にかかわるpyrE遺伝子が高度好熱菌でもマーカーとして使えることを初めて示した。更にロイシン合成系オペロンの配列をもち、一回相同組換えによる新しいインテグレーションベクターを作製した。このベクターを用いると外来遺伝子の発現が可能となる事は勿論、遺伝子の回収のために染色体DNAを調整後、適当な制限酵素処理の後自己結合することにより容易に大腸菌内にクローニングできるようなデザインとなっている。これらの改良型インテグレーションベクターを用いて、中等度好熱菌である程度耐熱化されたカナマイシン不活性化酵素の発現に成功し、高度好熱菌を用いて更に耐熱化するため系を作製した。
2.酵素の進化工学的耐熱化
1.で得られた大腸菌IPMDHを発現する好熱菌は選択培地上で53℃では生育できたが、その産物の耐熱性が低いために60℃で生育できなかった。その株を出発として自然に起きる突然変異により60℃でも生育可能となった株(EN604)、それを出発として更に耐熱化させ、65℃でも生育可能となった株(EST661)を得ることに成功した。これらの株から大腸菌IPMDHをコードする遺伝子を回収し、塩基配列解析を行ったところ、EN604ではN末端から106番目のアミノ酸残基であるセリンがイソロイシンに変わるような変異が起きていた(AGC→ATC)。この部位は活性中心をはさんだ二つのドメインを結ぶヒンジ領域にある。またEST661ではIPMDH遺伝子の上流にある別の遺伝子(leuD)上に5塩基の重複が観察された。
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