組換え蛋白質を抗原とした樹木のリグニン生合成酵素の免疫組織化学的解析

• 研究課題/領域番号: 08876016
• 研究種目: 萌芽的研究
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 応用微生物学・応用生物化学
• 研究機関: 東京農工大学
• 研究代表者: 川合 伸也 東京農工大学, 農学部, 助教授 (90202027)
• 研究期間 (年度): 1996 – 1997
• 研究課題ステータス: 完了 (1997年度)
• 配分額: 2,200千円 (直接経費: 2,200千円); 1997年度: 500千円 (直接経費: 500千円); 1996年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
• キーワード: リグニン / 樹木 / 免疫組織化学 / in situ hybridzation / ヤマナラシ / 遺伝子発現解析 / lignin(リグニン) / 樹木(tree) / ヤマナラシ(aspen)

研究概要

交雑ヤマナラシのフェニルアラニンアンモニア・リアーゼ、桂皮酸4-ハイドロキシラーゼ、コーヒー酸σメチルトランスフェラーゼ、シンナミルアルコール・デヒドロゲナーゼ、酸性ペルオキシダーゼの各遺伝子の全部、もしくは一部を大腸菌のヒスチジン・タグ融合蛋白質発現ベクターに連結して、大腸菌中でそれらの酵素蛋白質を生産させた。生産された蛋白質をヒスチジン・タグに対して特異的に親和性を持つニッケル・アガロースカラムを用いて精製した。これらの融合蛋白質を用い兎に免疫して一次抗体を作製した。作製した抗体の評価をウエスタン法で行い、単一の蛋白質を認識することを確かめ、免疫組織化学的手法に用いることが出来ることが判った。これらの抗体を用いて交雑ヤマナラシ中における時期及び組織特異的発現解析を行った。その結果、これらの蛋白質は主に維管束で発現しているが、傷害により組織非特異的に発現することが判った。また、維管束の中でも、時期により発現する細胞が決まっていることが判った。
更に、免疫組織化学的な解析に加えて、in situ hybrdizationによる遺伝子の発現解析を樹木に応用するための系を構築した。その結果、免疫組織化学的な解析では区別しにくい多重遺伝子族の発現を、プローブの選び方によってはin situ hybridizationを用いることで個々に選別することに成功した。