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「研究の目的」
これまでに、核以外のオルガネラである、葉緑体・ミトコンドリアにおけるCPDの光修復活性に関する研究は行われてきたが、不明な点が多い。このような中、申請者は、イネの各オルガネラにおいて、UVB照射により生成されたCPDが、青色光により修復されているという事実をこれまでの研究で得てきた。また、それはCPD光回復酵素によるものである可能性を示唆するデータも得る事ができた。
そこでまず、光回復酵素が、各オルガネラに局在している事を確かめた上で、どのようにしてCPD光回復酵素が、オルガネラDNA損傷の修復を行っているかを明らかにすることを目的に研究を行った。
「研究結果」
(1)免疫電顕法とウェスタンブロット法によるCPD光回復酵素の局在解析
CPD光回復酵素を過剰に発現しているセンス形質転換体ササニシキの切片サンプルを用いて免疫組織染色を行なった結果、核、葉緑体、ミトコンドリアにおいて、イネCPD光回復酵素のシグナルを確認した。また、核、葉緑体、ミトコンドリアをイネから単離し、それぞれの単離画分溶液を用いてウェスタンブロット解析を行った結果、各オルガネラ画分でのCPD光回復酵素の局在を確認した。
(2)GFP融合コンストラクトを用いた一過性発現解析による移行シグナル配列の探索
イネCPD光回復酵素の全長や一部をGFPと融合させたコンストラクトを作製し、パーティクルガン法により一過性発現解析を行い、移行シグナル配列の同定を行なった。その結果、イネCPD光回復酵素の核やミトコンドリアへの移行シグナル配列部位を同定した。
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