| 研究課題/領域番号 |
09044224
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| 研究種目 |
基盤研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用微生物学・応用生物化学
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| 研究機関 | 鳥取大学 |
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研究代表者 |
和泉 好計 鳥取大学, 工学部, 教授 (40026555)
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| 研究分担者 |
長澤 透 岐阜大学, 工学部, 教授 (60115904)
緒方 靖哉 九州大学, 農学部, 教授 (20038277)
大城 隆 鳥取大学, 工学部, 助手 (00233106)
田辺 忠 国立循環器病センター研究所, 薬理部, 部長 (60025624)
クック ポール・F オクラホマ大学, 化学生化学部, 教授
クック ポール.F オクラホマ大学, 化学生化学部, 教授
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| 研究期間 (年度) |
1997 – 1999
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| 研究課題ステータス |
完了 (1999年度)
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| 配分額 *注記 |
14,100千円 (直接経費: 14,100千円)
1999年度: 4,500千円 (直接経費: 4,500千円)
1998年度: 4,400千円 (直接経費: 4,400千円)
1997年度: 5,200千円 (直接経費: 5,200千円)
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| キーワード | C1微生物 / セリン経路 / メチロトローフ / X線結晶解析 / 動力学的反応機構 / イソクエン酸リアーゼ / セリンーグリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ / ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ / ヒドロキシピルビン酸レタクターゼ / 結晶化 / 基質-補酵素-酸素複合体 / メチロトーフ / Hyphomicrobium methylovorum / セリーングリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ / ヒドロキシビルビン酸レダクターゼ / C_1微生物 / セリン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ |
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| 研究概要 |
(1)C_1微生物に特異な新規酵素の精製と大量調製および酵素化学的特性の解明
C_1微生物Hyphomicrobium methylovorumの特異な新規酵素イソクエン酸リアーゼ(ILC)の精製と性質および一次構造の解析を行った。すなわち、まずHyphomicrobium属細菌におけるICL活性の分布について再検討した結果、SH保護剤としてジチオスレイトールゐ粗抽出液に添加し、ICL活性を特異的に測定することにより、すべてのHyphomicrobium属細菌に有意なレベルのICL活性が検出された。そこでH.methylovorumGM2からICLをメチロトローフとして初めて単一に精製し酵素化学的性質を解明した。これらの性質はC_2化合物代謝に関与するICLの性質と類似していた。セリンーグリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ(SGAT)については高発現ベクターを有するE.coli pKK223-3/SGATから得られた菌体を用いて酵素の大量精製を行い単一の標品100mg以上を得ることができた。
(2)C_1微生物に特異な新規酵素の結晶化とX線結晶解析
ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ(HPR)についてはすでに成功しているアポ型酵素の結晶化法を基に補酵素NADを結合させたホロ型酵素のbipyramid形の結晶を調製しX線結晶解析を行った結果、NADが予想された結合部位に入っていることがわかった。さらにアポ型の構造の触媒部位と基質結合部位の間のクレフトの角度に変化が起こっているという予想に反してアポ型のタンパク質と構造がほとんど変わらなかった。さらにホロ型酵素の結晶と本酵素の基質アナログとから基質-酵素複合体の結晶を取得したので、現在X線結晶解析中である。SGATについてはE.coli pKK223-3/SGATが生産した精製酵素をCrystal Screen Iを用いてhanging drop法により結晶化を行った結果、菱形板状の結晶を得た。この結晶化条件をもとにさらに現在良質の結晶を得るべく条件検討中である。
(3)C_1微生物に特異な新規酵素HPRの酵素化学的反応機構および動力学的反応機構の解析
SGATについてCook教授のグループによりストップドフロー法やCD、同位体標識した基質を用いて反応動力学的解析の結果、本酵素は他のトランスアミナーゼとは異なる新しい反応機構で触媒することがわかった。
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