| 研究課題/領域番号 |
09044228
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用微生物学・応用生物化学
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
松下 一信 山口大学, 農学部, 教授 (50107736)
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| 研究分担者 |
右田 たい子 山口大学, 医療技術短期大学部, 助教授 (90159161)
三芳 秀人 京都大学, 大学院・農学研究科, 助教授 (20190829)
山田 守 山口大学, 農学部, 助教授 (30174741)
外山 博英 山口大学, 農学部, 助手 (60240884)
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| 研究期間 (年度) |
1997 – 1999
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| 研究課題ステータス |
完了 (1999年度)
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| 配分額 *注記 |
7,300千円 (直接経費: 7,300千円)
1999年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円)
1998年度: 2,800千円 (直接経費: 2,800千円)
1997年度: 3,200千円 (直接経費: 3,200千円)
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| キーワード | ピロロキノリンキノン / キノプロテイン脱水素酵素 / グルコース脱水素酵素 / アルコール脱水素酵素 / X線構造解析 / Pseudomonas putida / 大腸菌 / 酢酸菌 |
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| 研究概要 |
本研究は、ピロロキノリンキノン(PQQ)を補酵素とするキノプロテイン脱水素酵素である大腸菌のグルコース脱水素酵素(GDH)および酢酸菌やPseudomonasに存在する異なる2種類のアルコール脱水素酵素(ADH)の構造と機能を、生化学、有機化学、遺伝子工学及びX線構造解析の手法を総合的に駆使して解明することを目的とし、3年間の研究によって以下に示す研究成果を得た。
1)大腸菌GDHの構造機能解析:GDHの変異体ランダム変異法と部位特異的変異法を組み合わせて調製し、細胞膜から精製したそれら変異体のキネティクス解析及び酸化還元スペクトル分析を基に、PQQの周辺で酸化反応に関与する部位と分子内電子移動反応に関与する部位について解析した。その結果とGDHモデル構造解析から、His-262、His775、Trp-404、Asp466、Asp730、さらにLys-493の機能を明かにした。2)酢酸菌ADH及び大腸菌GDHのユビキノン反応部位の解析:酢酸菌ADHにはユビキノン還元反応とは別にユビキノールを酸化する活性が存在することを発見し、その2つの部位が異なる領域に存在し、異なる立体構造をもつことを、数多くの合成フェノール系およびカプサイシン系ユビキノン阻害剤の阻害スペクトラムとユビキノン類似体の基質特異性の比較から明にした。GDHのユビキノン結合部位が膜の比較的表面に存在することも明かとなった。3)酢酸菌ADH及びPseudomonas ADHのX線構造解析:Type II ADH(ADH IIB)の結晶化とそれに続くx線結晶構造解析を行い、その構造を1.9Aレベルで解読すること成功した。また、酢酸菌の膜結合型ADHに関しては、その結晶化には成功し、部分的な解像は得られているものの、最終的な構造を得るにいたっていない。
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