| 研究概要 |
大腸菌で発現したPTTHの大規模精製系の確立-6xHis-tev-PTTHはPTTHの発現の場合と同じく封入体を形成した。従来法では、PTTHの封入体を8M尿素で可溶化した後、透析して巻き戻していたが、分子会合・沈殿を抑えるためにPTTH濃度を低くする必要があった(【less than or equal】30 μg/ml)。それゆえ、大容量の希薄タンパク質溶液を扱うこの方法は、大量調製には不向きであった。そこで、タンパク質間相互作用を抑えるために、6xHis-tev-PTTHをNi-NTA agaroseに結合させた状態で巻き戻したところ、6xHis-tev-PTTHが1mg/mlの高濃度であっても、会合・沈殿を抑えて、目的のホモダイマーを主産物として得ることができた。したがって従来法の1/30の液量で巻き戻しが可能になり、大腸菌で発現したPTTHの大量調製が効率的に行えるようになった。発現PTTHの大量調製法が確立したので、今後、結晶化条件の検討を
PTTHの2D^1_-HNMR解析-NMR法による立体構造解析は、結晶化を必要とせず、さらに、比較的初期に二次構造を決定できるので、X線結晶構造解析と相補的な構造解析手段である。NMR法によるPTTHの立体構造解析を進めるために、H_2O(pH6.0、HCI添加によりpH調整)に溶解した2mMPTTHの2D^1_-HNMRを測定した。broadなNMRシグナルとsharpなものが混在することから、PTTH分子がrigidなコア構造とflexibleな周辺部からなることが明らかになった。スペクトルの質から、安定同位体(^<13>C,^<15>N,^2H)標識PTTHを用いることで、NMR法による構造決定が可能なことが示された。
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