| 研究概要 |
ColE2プラスミドのDNA複製系では,複製開始にかかわるほとんどの機能がRep蛋白質に担われており,複製開始装置はRep蛋白質とDNA合成酵素Iを含むのみである.しかし,primer RNAは僅かに3残基であるので,複製開始時にはRep蛋白質-Ori部位-primer RNA-DNA合成酵素Iの複合体が形成される可能性が考えられる.Rep蛋白質のC末端側約2分の1のペプチド(RepC)は二重体を形成し,Ori部位に特異的に結合することができる.
本年度の研究成果:1)Ori部位の内部機能構造(特異的結合配列,特異的結合促進配列,primer RNAの鋳型配列,必須複製開始配列)の確証のため,Ori部位の全域にわたり野性型とは異なる3種の塩基置換を導入し,得られた変異Ori部位について,in vivoのRep蛋白質結合能,DNA複製能を調べた.その結果,変異の位置によってRep蛋白質結合能とDNA複製能に及ぼす影響の程度に大きな違いがある3つの領域が存在することが明らかとなった.これらの内,右端3分の1の領域の変異では,結合にほとんど影響がないにもかかわらず,複製に対してはその活性が検出できないような大きな影響がある.この領域はRep蛋白質の結合以後の反応(primer RNA合成,DNA合成)に関与していると考えられる.DNA合成酵素Iが塩基配列特異的に結合することが知られている大腸菌染色体上のPU繰返し配列と相同な10bp余りの配列がOri部位中に2ヶ所見い出された.2)6ヶのHisを付けたRepC(RepC-6xHis)を量産し,これをニッケルレジンに結合させたカラムとPCR法を用いて,ランダムな塩基配列を持つオリゴヌクレオチドからRepCに特異的に結合するものを選択,増幅した.8サイクルの操作後に多数のオリゴヌクレオチドの塩基配列を決定し,RepCの結合の共通配列を求めた.
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