| 研究課題/領域番号 |
09281217
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| 研究種目 |
重点領域研究
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
斎藤 能彦 京都大学, 医学研究科, 助手 (30250260)
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| 研究分担者 |
吉村 道博 熊本大学, 医学部附属病院, 助手 (30264295)
小川 佳宏 京都大学, 医学研究科, 助手 (70291424)
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| 研究期間 (年度) |
1997
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| 研究課題ステータス |
完了 (1997年度)
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| 配分額 *注記 |
1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
1997年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
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| キーワード | eNOS遺伝子 / 転写因子 / 遺伝的危険因子 |
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| 研究概要 |
冠攣縮性狭心症の危険因子は、欧米人に比べて日本人に高率に発症することにより、遺伝的危険因子の存在が示唆されている。熊本大学の泰江らは、NOの産生が低下していることを見いだし、内皮型NO合成酵素(eNOS)に機能異常が存在するか、発現量が低下している為と仮定した。この様な観点から、熊本大学の泰江らと我々は、すべてのエクソン及び5′転写調節領域(転写開始点より上流1.6Kbp)に対して一本鎖高次構造多型(SSCP)にて遺伝子変異を検索し、第7エクソンにmissense mutation(Glu298Asp)を、また、5′転写調節領域で3カ所の点変異を発見した。本年度はこれらの変異の機能解析を行った。
1)第7エクソンのmissense mutationによるeNOS遺伝子の機能解析
eNOScDNAの全長を含むクローンを得るために、ヒト胎盤cDNAライブラリーをスクリーニングし、野生型クローンと変異型クローンを得た。これらをCOS細胞へトランスフェクションし、それぞれの細胞におけるNO産生能は野生株と変異株で有為な差は認められなかった。また、これらのクローンを大腸菌にトランスフォーメーションし、リコンビナント蛋白を精製してMichaelis-Mentennoの式を求めて、Kmc値、Vmaxともに両者間で有意の差は認められなかった。
2)5′転写調節領域の点変異による転写活性に及ぼす機能解析
5′転写調節領域に存在する3つの点変異の転写活性に及ぼす効果を解析するために、野生型と3つの点変異を全て含んでいるeNOS遺伝子5′転写調節領域DNAフラグメントを、リポータージーンに結合し、ヒト血管内皮細胞にトランスフェクションすると変異は有意にルシフェラーゼ活性を低下させていることが明かとなった。
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