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キャプチャリングカセット法によるファージディスプレイライブラリーの速度論的選抜

研究課題

研究課題/領域番号 09450304
研究種目

基盤研究(B)

配分区分補助金
応募区分一般
研究分野 生物・生体工学
研究機関大阪大学

研究代表者

福崎 英一郎  大阪大学, 大学院・工学研究科, 助教授 (40273594)

研究分担者 片倉 哲雄 (片倉 啓雄)  大阪大学, 大学院・工学研究科, 助手 (50263207)
四方 哲也  大阪大学, 大学院・工学研究科, 助教授 (00222399)
研究期間 (年度) 1997 – 1999
研究課題ステータス 完了 (1999年度)
配分額 *注記
13,500千円 (直接経費: 13,500千円)
1999年度: 3,100千円 (直接経費: 3,100千円)
1998年度: 3,900千円 (直接経費: 3,900千円)
1997年度: 6,500千円 (直接経費: 6,500千円)
キーワードファージディスプレイ / 速度論 / スクリーニング / エステラーゼ / ヌクレアーゼ / 核酸 / 糖 / キャプチャリングカセット / 触媒抗体 / アルカリフォスファターゼ
研究概要

ランダムアミノ酸配列のライブリーを合成した。その性質を明らかにするために、1つのランダムアミノ酸配列を解析した結果、ランダムタンパク質(140アミノ酸)はモルテングロビュール程度のコンパクトさで微弱なエステラーゼ活性を持つことが分かった。理論的にはその活性のみのスクリーニングで大域的な高次構造が現れ、タンパク質の折り畳み問題が解消されることが分かった。このようなランダム配列を提示したファージライブラリーを構築し、DNA結合能のあるファージクローンの選抜を行った。ファージディスプレイシステムを利用したポジティブセレクションにおいて、イオン強度が重要なパラメーターであることを明らかにした。Staphylococcal nuclease(SNase)-DNAを酵素-基質のモデルとしてファージディスプレイによる酵素活性の速度論的選択系を開発した。SNaseを提示したファージを作製し、そのアミノ基をN-succinimidyl-6-maleimiddohexanoateで修飾した。末端の一方をチオール基で、他方をビオチンで修飾したDNAをPCRで調製し、それぞれの末端を、修飾したファージ及びstreptavidinビーズと反応させることによってファージを固相に固定した。SNaseをCa2+で活性化することによって、固相に固定されたSNaseファージが溶離することが確認できた。代表的中性多糖の一つであるキチンを特異的に認識するDNAアプタマーをインビトロセレクションの手法により取得することに成功した。59残基のランダム配列を有するオリゴDNAライブラリーを探索源として、8ラウンドアフィニティーセレクションを経て得られたDNAをクローニングし、各クローンの塩基配列を比較したところ、各クローンとも、4 9個のグアニンクラスターを有し、その周辺に回文配列が認められた。二次構造予測を行ったところ、いずれもグアニンクラスターをループに持つステムループあるいはバルジループの構造を示した。

報告書

(4件)
  • 1999 実績報告書   研究成果報告書概要
  • 1998 実績報告書
  • 1997 実績報告書
  • 研究成果

    (17件)

すべて その他

すべて 文献書誌 (17件)

  • [文献書誌] Tetsuya Yomo et al.: "Nonaddictivity of mutational effects on the properties of catalasel and its application to efficient directed evolution"Protain Engineering. 11(9). 789-795 (1999)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      1999 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Tetsuya Yomo et al.: "Characterization of soluble artificial with random sequences"Tetrahedron Letters. 39. 3737-3740 (1998)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      1999 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Tetsuya Yomo et al.: "Properties of artificial proteins with random sequences"Febs Letters. 421. 147-151 (1998)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      1999 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Tetsuya Yomo et al.: "Gradual development of protein-like global structures through functional selection"Nature Structural Biology. 6. 743-746 (1999)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      1999 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Yoshio Katakura et al.: "The importance of ionic strength as a parameter in screening peptide ligands from a phage display library"Journal of Fermentation and Bioengineering. 85. 447-450 (1998)

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      1999 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Eiichiro Fukusaki et al.: "DNA aptamers that bind to chitin."Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 10(In press). (2000)

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      1999 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Katakura, Y., Lim, E., Tujii, S., Omasa, T., and Suga, K.: "The importance of ionic strength as a parameter in screening of peptide ligands from phage display libraries."J. Ferm. Bioeng.. 85. 447-450 (1998)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1999 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Tetsuya Yomo, lrfan D. Prijambada, Keizo Yamamoto, Yasufumi Shima, Seiji Negoro, ltaru Urabe: "Properties of artificial proteins with random sequences."Annals of the New York Academy of Sciences. 864. 131-135 (1999)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1999 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Tomoaki Matsuura, Tetsuya Yomo, Savitr Trakulnaleamsai, Yoshinori Ohashi, Keizo Yamamoto, Itaru Urabe: "Nonadditivity of mutational effects on the properties of catalase I and its application to efficient directed evolution."Protein Engineering. 11. 789-795 (1998)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1999 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Asao Yamauchi, Tetsuya Yomo, Fumihiro Tanaka, Irfan D. Prijambada, Seiji Ohhashi, Keizo Yamamoto, Yasufumi Shima, Kyoko Ogasahara, Katsuhide Yutani, Mikio Kataoka, Itaru Urabe: "Characterization of soluble artificial with random sequences."FEBS Letters. 421. 147-151 (1998)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1999 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Tetsuya Yomo, Seiji Saito, Masaki Sasai: "Gradual development of protein-like global structures through functional selection."Nature Structural Biology. 6. 743-746 (1999)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1999 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Ei-ichiro Fukusaki, Takahisa Kato, Hiroshi Maeda, Naoki kawazoe, Yoshihiro Ito, Atsushi Okazawa, Shin-ichiro Kajiyama and Akio Kobayashi: "DNA aptamers that bind chitin."Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters.. 10 (in press). (2000)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1999 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Fukusaki, E. et al.: "DNA aptamer that binds to chitin"Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 10(4)(印刷中). (2000)

    • 関連する報告書
      1999 実績報告書
  • [文献書誌] Yomo, T. et al.: "Gradual development of protein-like global structures through functional selection"Nature Structural Biology. 6(8). 743-746 (1999)

    • 関連する報告書
      1999 実績報告書
  • [文献書誌] T.Yomo: "Properties of artificial proteins with random sequences." Ann NY Acad Sci.13. 131-135 (1998)

    • 関連する報告書
      1998 実績報告書
  • [文献書誌] T.Yomo: "Nonadditivity of mutational effects on the properties of catalase I and its application to efficient directed evolution." Protein Eng.11. 789-795 (1998)

    • 関連する報告書
      1998 実績報告書
  • [文献書誌] T.Yomo: "Characterization of soluble artificial proteins with random sequences." FEBS Lett.421. 147-151 (1998)

    • 関連する報告書
      1998 実績報告書

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公開日: 1997-04-01   更新日: 2016-04-21  

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