| 研究課題/領域番号 |
09450304
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
生物・生体工学
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
福崎 英一郎 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助教授 (40273594)
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| 研究分担者 |
片倉 哲雄 (片倉 啓雄) 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助手 (50263207)
四方 哲也 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助教授 (00222399)
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| 研究期間 (年度) |
1997 – 1999
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| 研究課題ステータス |
完了 (1999年度)
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| 配分額 *注記 |
13,500千円 (直接経費: 13,500千円)
1999年度: 3,100千円 (直接経費: 3,100千円)
1998年度: 3,900千円 (直接経費: 3,900千円)
1997年度: 6,500千円 (直接経費: 6,500千円)
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| キーワード | ファージディスプレイ / 速度論 / スクリーニング / エステラーゼ / ヌクレアーゼ / 核酸 / 糖 / キャプチャリングカセット / 触媒抗体 / アルカリフォスファターゼ |
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| 研究概要 |
ランダムアミノ酸配列のライブリーを合成した。その性質を明らかにするために、1つのランダムアミノ酸配列を解析した結果、ランダムタンパク質(140アミノ酸)はモルテングロビュール程度のコンパクトさで微弱なエステラーゼ活性を持つことが分かった。理論的にはその活性のみのスクリーニングで大域的な高次構造が現れ、タンパク質の折り畳み問題が解消されることが分かった。このようなランダム配列を提示したファージライブラリーを構築し、DNA結合能のあるファージクローンの選抜を行った。ファージディスプレイシステムを利用したポジティブセレクションにおいて、イオン強度が重要なパラメーターであることを明らかにした。Staphylococcal nuclease(SNase)-DNAを酵素-基質のモデルとしてファージディスプレイによる酵素活性の速度論的選択系を開発した。SNaseを提示したファージを作製し、そのアミノ基をN-succinimidyl-6-maleimiddohexanoateで修飾した。末端の一方をチオール基で、他方をビオチンで修飾したDNAをPCRで調製し、それぞれの末端を、修飾したファージ及びstreptavidinビーズと反応させることによってファージを固相に固定した。SNaseをCa2+で活性化することによって、固相に固定されたSNaseファージが溶離することが確認できた。代表的中性多糖の一つであるキチンを特異的に認識するDNAアプタマーをインビトロセレクションの手法により取得することに成功した。59残基のランダム配列を有するオリゴDNAライブラリーを探索源として、8ラウンドアフィニティーセレクションを経て得られたDNAをクローニングし、各クローンの塩基配列を比較したところ、各クローンとも、4 9個のグアニンクラスターを有し、その周辺に回文配列が認められた。二次構造予測を行ったところ、いずれもグアニンクラスターをループに持つステムループあるいはバルジループの構造を示した。
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